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Doktorarbeit Kathrin Eglmeier Korrektur 4
Doktorarbeit Kathrin Eglmeier Korrektur 4
FÜR ANÄSTHESIOLOGIE
PROF. DR. BERNHARD GRAF
DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN
DER UNIVERSITÄT REGENSBURG
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizin
der
Fakultät für Medizin
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Kathrin Eglmeier
2019
AUS DEM LEHRSTUHL
FÜR ANÄSTHESIOLOGIE
PROF. DR. BERNHARD GRAF
DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN
DER UNIVERSITÄT REGENSBURG
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizin
der
Fakultät für Medizin
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Kathrin Eglmeier
2019
Dekan: Prof. Dr. Dr. Torsten E. Reichert
1 Einleitung ................................................................................... 1
1.1 Perioperative Myokardinfakt (POMI) .......................................................... 2
1.2 Kardioprotektion durch Konditionierung .................................................. 3
1.3 Ischämische Präkonditionierung (IPC) ...................................................... 4
1.4 Anästhetika induzierte Präkonditionierung (APC) .................................... 5
1.5 Ischämische Fernkonditionierung (RIPC) ................................................. 6
1.6 Grenzen der Tierversuchsmodelle und daraus resultierende
kontroverse Ergebnisse im klinischen Umfeld ......................................... 8
1.7 Mechanismen des IPC und RIPC................................................................ 9
1.8 Endotheliale Dysfunktion ......................................................................... 11
1.9 Experimentelle Atherosklerose-Modelle ................................................. 12
1.10 Fragetellung ....................................................................................... 15
3 Ergebnisse ............................................................................... 30
3.1 Einfluss der Ischämischen Fernkonditionierung auf die Infarktgröße bei
C57BL6N Mäusen ...................................................................................... 30
3.2 Einfluss der Ischämischen Fernkonditionierung auf die Infarktgröße bei
LDLR-/- Mäusen ....................................................................................... 32
3.3 Experimente zum Nachweis von Atherosklerose ................................... 34
3.3.1 Messung der endothelialen Funktion ................................................. 34
3.3.2 Histologische Schnitte ....................................................................... 36
4 Diskussion ................................................................................ 38
5 Zusammenfassung .................................................................. 47
6 Literaturverzeichnis ................................................................. 49
Abkürzungsverzeichnis:
AAR Area at risk
ACh Acetylcholin
APC Anästhetika induzierte Präkonditionierung (engl.
anaesthetic preconditioning)
apoE-/- apoE-Gen deletiert
-/-
LDLR LDL-Rezeptor-Gen deletiert
miRNA microRNA
BL Baseline
CAO Koronararterienokklusion (engl. Coronoary artery
occlusion)
eNOS Endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase
IA Infarktareal
IPC Ischämische Präkonditionierung (engl. Ischemic
preconditioning)
IRS Ischämie-Reperfusions-Schaden
IS Infarktgröße (engl. infarct size)
L-Name N-nitro-L-Arginin-Methylester
LV Linker Ventrikel
MAC Minimale alveoläre Konzentration
MAP Mittlerer arterieller Druck; (engl. mean arterial
pressure)
MEM Memoryphase
mPTP Mitochondriale Permeabilitäts-Transitions-Pore
(engl. mitochondrial permeability transition pore)
NA Noradrenalin
NO Stickstoffmonoxid
POMI Perioperativer Myokardinfarkt (engl. perioperative
myocardial infarct)
REP Reperfusion
RIPC Ischämische Fernkonditionierung (engl. ischemic
preconditioning)
ROS Reaktive Sauerstoffradikale (engl. reactive oxygen
species);
SEVO Sevofluran
SNP Natrium Nitroprussid (engl. sodium nitroprusside)
TIVA Totale intravenöse Anästhesie
1 Einleitung
Weltweit werden jährlich ca. 200 Mio. abdominalchirurgische Operationen
sollen kardiovaskuläre Risikopatienten evaluiert und ein auf den jeweiligen Patienten
Möglichkeiten der Anästhesie stoßen damit an ihre Grenzen und verlangen nach
ist die Konditionierung. Hierunter versteht man „einen Mechanismus, der es einem
1
besser zu überstehen. Die Idee, dass ein Zielorgan einem Reiz ausgesetzt wird, um
auf einen nachfolgenden ähnlichen bzw. stärkeren Reiz vorbereitet zu sein, nennt
stattfindet. Im Gegensatz zum akuten Koronarsyndrom stellt sich der POMI meist
klinisch stumm dar und kann nur mithilfe von EKG-Veränderungen (z.B. neu
unterschieden. Der Typ I oder auch das akute Koronarsyndrom ist einer akuten
folgender lokaler Okklusion oder distaler Embolisation (5). Ein länger andauerndes
den Typ II. Perioperative Faktoren, wie Blutungen, welche Anämie und Hypotension
Tachykardie und Vasokonstriktion (5). Experten vermuten, dass die Inzidenz des Typ
II POMI höher ist als die eines durch Plaqueruptur bedingten MIs, vor allem
Das Risiko für ein kardiales Ereignis kann intra- und postoperativ günstig beeinflusst
2
werden, indem die myokardiale Sauerstoff-Bilanz verbessert und durch die
frühzeitige Detektion von beispielsweise ST-Senkungen das Risiko für einen IRS
reduziert wird (7). Letzterer tritt als Komplikation auf, sobald ein Gewebe einen
der Dauer der Ischämie zu einem apoptotischen und nekrotischen Zelluntergang. Die
durch den Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) verursacht wird. Die frühzeitige
Erkennung eines IRS und die günstige Beeinflussung der O₂-Bilanz, wie sie
beispielsweise durch eine optimale Volumen- und Druckbelastung des Herzens, das
mmHg, sowie eine Herzfrequenz zwischen 60 – 80/ min erlangt wird, sind nicht die
stellt eine innovative Strategie zur Reduktion bzw. Prävention kardialer Ereignisse
dar (7).
Konditionierung bezeichnet. Je nachdem, ob der Stimulus vor der Ischämie oder vor
der Reperfusion einsetzt, spricht man von Prä- oder Postkonditionierung. Im Fall der
Konditionierung des Myokards stellt der IRS das schädliche Ereignis dar. Durch die
Präkonditionierung) wird eine höhere Ischämietoleranz der Zellen erlangt und so ein
3
kardioprotektiver Effekt bewirkt. Die Art der Stimuli kann unterschiedlich sein. So
Edelgase (8), Adenosin (9), Opioide (10) sowie volatile Anästhetika (Anästhetika
induzierte Präkonditionierung) (11) eine günstige Wirkung auf die Folgen des IRS zu
haben.
Präkonditionierung. Sie lässt sich in allen bisher untersuchten Spezies und mehreren
Organen nachweisen (12). Dieses Phänomen beschrieb Murry et al. erstmals 1986.
Ischämie und Reperfusion des linken Ramus ventricularis anterior vor einer 40
Infarktgröße um 75 % verringert werden konnte (13). Die Wirkung von IPC konnte
darauffolgenden Jahres führen (14). In einer Metaanalyse zur Rolle von IPC bei
bestimmten klinischen Situationen inadäquat ist und eine schädliche Wirkung haben
kann (16).
4
1.4 Anästhetika induzierte Präkonditionierung (APC)
Volatile Anästhetika reduzieren die Arbeitsleistung des Herzens und senken so den
kardioprotektiv zu wirken (13). Freedman et al. war der Erste, der einen
Rattenherzen wurde demonstriert, dass die Gabe von 2%igem Enfluran vor einem
ähnlich starke Wirkung konnte durch eine Applikation von Isofluran über 30 Minuten
erreicht werden (11). Kehl et al. zeigten, dass Isofluran bereits bei einer minimalen
Eingriffe boten sich für klinische Studien an, da sie hoch standardisiert sind.
Troponin, welches stark mit dem klinischen Outcome korreliert (19), als Endpunkt
gewählt (20). Lee et al. untersuchten die Wirkung von Isofluran bei Patienten, welche
5
sich einer koronaren Bypass-Operation unterzogen. Die 15-minütige Applikation des
Abklemmen der Aorta ergab eine signifikant niedrigere Konzentration von Troponin I
24 h nach der Operation im Vergleich zur Kontrollgruppe (21). Auch für Desfluran,
bei Patienten, welche mit Propofol anästhetisiert wurden (22). In einer Metaanalyse,
welche 3642 Patienten aus 38 Studien einschloss, war die postoperative Mortalität
(TIVA) doppelt so hoch im Vergleich zur Gruppe mit volatiler Anästhesie (23).
Allerdings existieren auch mehrere Studien, die keine kardioprotektive Wirkung durch
volatile Anästhetika zeigen (24,25). Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der
Ergebnissen in klinischen Studien ist die Tatsache, dass sich überwiegend kardiale
unterziehen (20).
klinischen Setting hoffen. Allerdings stellte sich deren Umsetzung aufgrund der
Entwicklung einer neuen, erfolgreichen Methode zur Minimierung des IRS. Beim
6
RIPC führt die Applikation kurzer Episoden von Ischämie und Reperfusion an einem
liegender Organe gegenüber einem IRS (27). Das Phänomen der „Kardioprotektion
aus der Ferne“ (28) wurde zum ersten Mal 1993 von Pryzklenk et. al beschrieben.
Ischämien anderer Organe, wie z. B. der Niere (29) oder des kleinen Intestinums (30)
Organe konnten durch RIPC vor einem IRS geschützt werden (31). Die Problematik
der Invasivität der zuvor genannten Untersuchungen schuf den Anreiz für weitere
Präparation und Kompression der A. femoralis (32–34) hin zur einfachen Methode,
optimalen RIPC-Zyklus ergaben, dass vier bis sechs Zyklen eine signifikante
Episode schwächte die Wirkung ab (36). In dieser Arbeit wurden 3 Zyklen RIPC
7
bestehend aus fünfminütiger Hinterlaufischämie und ebenso langer Reperfusion am
Hinterlauf der Maus appliziert. 2002 zeigte Kharbana et al. in vorläufigen klinischen
Oberarm nicht invasiv umgesetzt werden konnte. Durch das Aufpumpen wird eine
kurze ungefährliche Ischämie induziert und nach Ablassen des Drucks die
kardioprotektive Wirkung durch RIPC nachwies (38–41), hatte in einigen Studien die
RIPC und anderer Konditionierungsformen ins klinische Umfeld und für die
Variabilität der Ergebnisse verantwortlich scheinen (46). Zum einen scheint ein
der Klinik ein POMI entweder durch die Ruptur eines instabilen atherosklerotischen
Plaques oder ein Missverhältnis der myokardialen O₂-Bilanz entsteht, wird im in vivo
Modell der Infarkt durch die Okklusion einer gesunden Koronararterie von außen
herbeigeführt. Zudem ist die Reperfusion durch PCI eher mit einer verbleibenden
Unterschiede existieren bei der Dauer von Ischämie und Reperfusion sowie dem
8
Abschätzung des Schadens herangezogen werden. Zudem variiert die
Pathophysiologie des IRS mit der klinischen Situation. Der IRS, welcher beim akuten
STEMI entsteht, unterscheidet sich von jenen, welche bei Eingriffen, wie koronarer
männlichen, kleinen Versuchstieren in jungem Alter dar. Diese weisen keine Co-
stellen sich Patienten mit ischämischer Herzerkrankung erst in höherem Alter vor (55
bis 65 Jahre oder älter). In experimentellen Studien müssten deshalb 21-24 Monate
alte Mäuse oder Ratten verwendet werden, um diesem Alter zu entsprechen. Auch
viele Patienten zahlreiche Co-Morbiditäten mit und steigern dadurch ihr kardiales
(47).
(mPTP), welche auf der inneren Mitochondrienmembran sitzt. Ist diese geöffnet,
kommt es zum Einstrom von Wasser, dadurch zur Schwellung der Organellen, der
9
Freisetzung von intermembranärem Cytochrom C und damit zur Einleitung der
und RIPC ähnlich abläuft (49), ist beim RIPC der Mechanismus, welcher das am
entfernten Organ generierte protektive Signal zum Zielorgan bringt noch ungelöst.
Studien deuten auf eine Beteiligung von sowohl humoralen Faktoren als auch
neuronalen Wegen hin. Beim RIPC folgt einer kurzen Ischämie des entfernt
liegenden Organs stets eine Phase der Reperfusion. Man kann annehmen, dass
Faktor auszuwaschen und über den Kreislauf zum Zielorgan zu transportieren (30).
Die experimentelle Studie von Shimizu et al., in welcher die Transfusion von Plasma
isolierten Empfängerherz wirkt (50), ist eine von vielen Untersuchungen (51–53), die
die Hypothese von humoralen Faktoren unterstützt. Proteine, wie Kallistatin (54),
Apolipoprotein A-I (55) und stromal-derived-factor 1α (SDF 1α) (56), aber auch
andere Mediatoren, wie microRNAs (miRNA) (49,57), Bradykinin (58), Adenosin (59)
sowie Stickstoffmonoxid (NO) (60) bzw. Nitrit (61) werden als humorale Faktoren
dass diese signifikant an der Übermittlung der Kardioprotektion beteiligt sind (27).
Allerdings wirkt sich Nitrit mit einer Halbwertszeit von 60 Minuten (62) positiv auf den
IRS aus (63). Es wird angenommen, dass die bei der Ischämischen
Bildung führen, welches wiederum zu Nitrit oxidiert wird. Über den Blutkreislauf
gelangt Nitrit zur Zielzelle, dem Kardiomyozyten, wo während des IRS mithilfe von
10
Myoglobin eine Reduktion zu NO stattfindet. Dieses führt über eine nachgeschaltete
dass ein protektives Signal ohne die Beteiligung von neuronalen Wegen nicht
übertragen werden kann. Dass vermutlich sowohl humorale Faktoren als auch
notwendig sind, zeigte eine Studie mit Diabetes-Patienten. Jensen et al. fand heraus,
dass das Plasma-Dialysat von mit RIPC behandelten Diabetikern mit peripherer
eine anti-inflammatorische Wirkung der RIPC wird diskutiert (71). Die Recherche
zeigt, dass der zugrundeliegende Mechanismus des RIPC durch ein komplexes
gehören neben dem Diabetes mellitus (72) vor allem die endotheliale Dysfunktion
(73). In einem Versuch mit eNOS- und iNOS gendeletierten Mäusen konnte gezeigt
werden, dass bei diesen keine Präkonditionierung mit volatilen Anästhetika möglich
war (73). Eine eingeschränkte NOS-Aktivität ist ein typisches Merkmal der
11
Aufgrund der hohen Prävalenz dieser Erkrankung in unserer Gesellschaft ist es
humanen Läsionen aufweisen. Die Limitationen dieser Studien waren bedingt durch
murinen Modells der Atherosklerose löste die Probleme und Defizite von Studien mit
großen Tierarten und erlaubte sogar Untersuchungen mit großen Fallzahlen, welche
für die Entwicklung neuer Therapien notwendig sind (74). Die Maus als Spezies weist
Atherosklerose (75). Eine Ausnahme stellt der C57Bl6 Stamm dar. Unter
allem auf die Aortenwurzel beschränkt sind (76). Es handelt sich allerdings um sehr
Anzeichen für eine Beteiligung glatter Muskelzellen aufweisen. Die ersten Versuche
12
zur Entwicklung eines Diät-induzierten Atherosklerose-Modells zeigten, dass ein zu
Gewichtsverlust der Nager und Erkrankung der Tiere führten. Die Entstehung der
bedingt (74).
eine zentrale Rolle im sowohl humanen als auch murinen Fettstoffwechsel einnimmt.
in die Leber (78). 1992 wurden erstmals apoE-/- Mäuse mittels homologer
sind. Bereits im Alter von 5 bis 6 Wochen kommt es zur Adhäsion von Monozyten an
die endotheliale Oberfläche. Mit 6 bis 10 Wochen entwickeln sich fatty streak
media der Aorta und führen so zur Entstehung von Aneurysmen (79). Unter einer
„western-type diet“, welche 21% Fett und 0,15% Cholesterin enthält, verdreifacht sich
13
beschleunigt, so dass 10 Wochen alte Tiere, welche die obengenannte Diät für fünf
Wochen konsumieren, drei bis viermal größere Läsionen entwickeln als gleichaltrige
Stammzellen erstmals eine LDLR-/- Maus (81). Ein Großteil der Lipoproteine, welche
von der Leber sezerniert wird. Während der Zirkulation im Blut werden zahlreiche
Triglyceride durch die Lipoproteinlipase vom VLDL mittels Hydrolyse entfernt und es
entsteht das IDL, welches rasch in die Leber aufgenommen wird. Der Grund für die
rasche Aufnahme ist, dass IDL den Liganden apoE enthält, welcher eine hohe
LDL. Dieses wiederum enthält apoB-100, welches nur schwer an den LDL-Rezeptor
Chylomikrone, welche die Liganden apoE und apoB-48 enthalten, können zusätzlich
apoB-48 auch in VLDL vor, weshalb bei funktionslosem LDL-Rezeptor ein Teil der
Mäuse unter einer Standartnahrung (Fett: 4-6%; Cholesterol: < 0,02%) lediglich
14
Komplexität zunehmen (75). Die „western-type diet“ wirkt allerdings nicht nur
Steatosis hepatis und Gastritis (83) sind Folgen der hochkalorischen Nahrung (82).
darstellt (75).
1.10 Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir zum einen, ob sich RIPC im in vivo
Herzinfarktmodell der Maus umsetzen lässt sowie das Ausmaß der Infarktreduktion
über einen längeren Zeitraum mit hochkalorischer Nahrung gefüttert. Durch Messung
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Hypothesen zu testen, dass
15
2 Material und Methoden
2.1 Versuchsgenehmigung
Das Versuchsvorhaben wurde unter dem Aktenzeichen 54-2532.1-18/14 genehmigt.
2.2.1 Versuchstiere
Man verwendete männliche C57BL6N Mäuse, welche zum Zeitpunkt der
Versuchsdurchführung 8 Wochen alt waren und ein Gewicht von 20-25 g hatten. Für
wir männliche LDLR-/- Mäuse (Stamm B6.12957-Ldlr tmlHer/J, Stock #002207; Alter 8
Wochen) mit hochkalorischem Futter (SM M-Z, atherogen, +1% Cholesterin, Basis
V1124, ohne Extrafett, ssniff Spezialdiäten GmbH) über einen Zeitraum von 14 bis
16 Wochen (82). Bei der Durchführung des Versuchs betrug ihr Gewicht zwischen 25
und 35 g. Beide Mäusestämme bestellten wir bei Charles River. Die Tiere wurden
16
(Sigma-Aldrich®); L-NAME Hydrochloride (Sigma-Aldrich®); Natrium Nitroprussid
Dihydrat (Sigma-Aldrich®)
Bauchfell eingeleitet. Nach der Applikation wurden ca. 5 min Einwirkzeit abgewartet,
bevor das Versuchstier auf dem OP-Tisch fixiert werden konnte. Die Narkose hielt
ca. 90 bis 120 min an, bevor in 15 mg/kg Schritten die Anästhesie weiter vertieft
wurde. Das narkotisierte Tier wurde rücklings auf die 3,5 cm x 7,5 cm große
Heizplatte des OP-Tisches gelegt und mit dem Gebiss unter einem Gummiband
fixiert. Dem Tier war eine eigenständige Regulierung der Körpertemperatur noch
möglich, da der Schwanz nicht mehr auf der Wärmeplatte lag. Eine Fixierung der
welchen die Pfoten des Versuchstiers auf den EKG-Pads befestigt wurden. Über
werden.
2.2.5 Operationsschritte
Tracheotomie
Die Maus erhielt zur Sicherstellung der Atemwege eine Tracheotomie. Dazu wurde
ein Hautschnitt von der Kehle bis zum Brustbein durchgeführt. Anschließend wurde
die Trachea freipräpariert, mit einer Pinzette fixiert und mit einer Schere leicht
angeritzt, um den Tubus, eine 22 G Kanüle, einführen zu können. Die Kanüle wurde
angesteckt. Der Tubus wurde außerdem mit einem Doppelknoten fixiert. Dazu wurde
unter der Trachea ein ca. 10 cm langer mit NaCl angefeuchteter Faden (Resorba
17
Seide schwarz H3F 4/0, 1,5 metric) hindurchgezogen. Der Beatmungsschlauch
wurde auf dem OP-Tisch mit Tupfer und Klebestreifen fixiert, um beim Bewegen des
Fluss von 0,3 l/min Frischgaszufuhr und eine Atemfrequenz von 120/min eingestellt.
über einen in die rechte A. carotis communis eingeführten Katheter, welcher mit
wurden die Tonsillen zur Seite gelegt. Es empfahl sich einen möglichst langen
vorzubehalten. Mittels einer Pinzette wurde das umliegende Gewebe gedehnt und
die Arterie vom mitlaufenden N. vagus befreit. Anschließend wurde mit einer Pinzette
ein mit NaCl angefeuchteter doppelt gelegter ca. 30 cm langer Faden (Resorba
Seide schwarz H1F 6/0, 0,7 metric) unter der Arterie durchgezogen, welcher am
Doppelende durchtrennt wurde, so dass zwei Fäden entstanden. Mit beiden Fäden
wurde ein Knoten vorgelegt. Der kaudal liegende Knoten wurde in eine Klemme
eingelegt und locker nach kaudal gezogen. Der zweite Knoten wurde soweit wie
möglich kranial gesetzt, gestrafft und am Tubus fixiert. Durch Ziehen der Klemme
nach kaudal, wurde die Arterie gestrafft, um diese mit einer Federschere zu
punktieren. Mithilfe eines kleinen Häkchens wurde die Arterie von rechts angehoben.
Von links kommend wurde dann mit einer Pinzette der Arterienschlauch eingeführt,
nach kaudal geschoben und gerade ausgerichtet. Danach wurde der kaudal liegende
Faden zugeknotet. Eine weitere Fixierung des Arterienschlauchs erfolgte über ein
18
mittels des Transducerspülsystems mit 0,1ml NaCl gespült und die Arterie mit dem
Druckabnehmer genullt.
Brustbein vorgenommen. Mithilfe einer Pinzette wurde die Haut vom Gewebe gelöst.
Der Längs- und Quermuskel wurde mit einem Kauter am Brustbein abgetrennt und
zur Seite geklappt. Das über den linken Rippenbogen laufende große Blutgefäß
wurde koaguliert und anschließend die erste Rippe durchtrennt. Mit dem
sichtbar wurde.
Arterienligatur
Der Herzbeutel wurde mit 2 Klammern nach vorne gezogen, so dass das Herz nach
vorne verlagert wurde. Das Perikard wurde so weit oben eröffnet, bis das rechte
Atrium gut sichtbar war. Mit einem in NaCl getränkten Tupfer wurde über das Herz
Arterienligatur wurde das Herz mit einem Tupfer nach links kaudal gedrückt und
fixiert. Mit der Nadel wurde möglichst weit kranial schräg unterhalb der Arterie
eingestochen und das Gefäß mit dem Faden umschlungen (6-0). Der Rippenspreizer
wurde gelöst und die Muskelstränge wieder über das Herz gelegt. Über die offenen
2.2.6 Versuchsprotokoll
Nach Vollendung der Arterienligatur begann die sogenannte Baseline (BL), eine
Zeitspanne, welche dazu diente, dass sich Herzfrequenz (HF) und MAP nach den
19
verschiedenen Versuchsgruppen zugeordnet. Alle Tiere erhielten eine Narkose mit
eine Reperfusion (REP) von 180 Minuten. In der APC-Versuchsgruppe wurde nach
15 Minuten BL, für 15 Minuten 1,0 (MAC) Sevofluran (SEVO) appliziert und weitere
15 Minuten die Memoryphase (MEM) abgewartet. CAO und REP folgten. Die
und RIPC verwendet. HF und MAP wurden in allen Versuchsgruppen jeweils nach
der BL, CAO sowie nach der 60., 120. und 180. Minute Reperfusion gemessen.
Hinterlaufischämie
Als Manschette diente ein abgeschnittenes 3 ml Kryoröhrchen, welches über den
linken Hinterlauf gezogen wurde. Zwischen Bein und Röhrchen wurde ein 3,0 mm
großer Endotrachealtubus eingeführt, welcher mit einer Pumpe verbunden war. Über
20
diese konnte ein Druck von 2 bar aufgebaut werden, bei welchem die arterielle
worden war, wurde ein kleiner Tubus aufgefädelt. Danach wurden diese an zwei 2,0
Okklusion wurden die Cups über die Nadeln gehängt, so dass diese frei in der Luft
hingen. Dadurch wurde der Tubus auf die Arterie gedrückt und die Blutzufuhr
unterbrochen. Am EKG zeigte sich zu Beginn eine ST-Hebung. Der linke Ventrikel
erschien blasser und die Blutgefäße traten dunkler hervor. Zum Beenden der
Okklusion wurden die Cups gleichmäßig angehoben und auf dem Operationstisch
abgelegt. Die Fäden wurden von den Eppendorf-Cups gelöst und der Silikon-Tubus
mit einer Pinzette entfernt. Die Reperfusion des linken Ventrikels setzte wieder ein
21
Abbildung 2: Versuchsaufbau des in vivo Herzinfarktmodells.
Herzentnahme
Der Versuch wurde mit der Herzentnahme beendet. Die Applikation von 0,35 ml
Heparin über den Arterienkatheter führte zur Lyse von Thromben, welche aufgrund
von koaguliertem Blut entstanden waren und machte den Zugang wieder
durchgängig. Der bereits vorgelegte Doppelknoten wurde zugezogen und damit die
über den Arterienkatheter gegebene Evans-Blue (1 ml) verteilte sich im Körper der
Maus. Mit einer Pinzette wurde das Herz am Gefäßstrang gegriffen und leicht
angehoben. Mit einer Schere wurde der Gefäßstrang oberhalb der Pinzette
22
Entfernung des rechten Ventrikels
Das Herz wurde mit einer Kanüle so am Apex fixiert, dass der rechte Ventrikel nach
oben zeigte. Nach einer Spülung des Herzens mit NaCl, um restliche Farbe zu
Federschere die Vorhöfe entfernt. Anschließend glitt man mit einer Pinzette in den
rechten Ventrikel, hob ihn leicht an und schnitt dann entlang des Septums keilförmig
23
Nach Befüllung der Eppendorf-Cups mit dem jeweiligen Schnitt wurden diese
nochmals für 25 min. bei 37°C im Thermomixer mit einer Frequenz von 450 pm
geschüttelt. Danach legte man die Herzschnitte in Petrischalen und bedeckte sie mit
man sie geordnet vom Apex bis zur Basis von links nach rechts auf einen
Objektträger. Ein zweiter Objektträger wurde darüber platziert und zwischen die
Glasplättchen so viel Natriumchlorid gespritzt, bis alle Schnitte umspült waren. Die
Schwanenhalslampe bestrahlt. Die Hälse der Lampe wurden so eingestellt, dass die
Kegel fast kongruent überlappten und so den jeweiligen Schnitt gut beleuchteten. Die
(Canon EOS 500D) angeschlossen war. Das Mikroskop war auf eine 25-fache
verwendet, um eine Unschärfe der Bilder, die durch die Berührung der Kamera
entstehen hätte können, zu vermeiden. Bei jedem Schnitt wurde das Bild mithilfe des
und Objektträger fuhr und anschließend zügig kippte. Nachdem von jedem Schnitt
jeweils von der apikalen als auch der basalen Seite ein Foto angefertigt worden war,
wurden die Schnitte in ein mit Formaldehyd befülltes Eppendorf Cup gegeben, mit
der jeweiligen Nummer der Maus beschriftet und bei -20°C eingefroren.
24
2.2.9 Auswertung mit Adobe Photo Shop
Die Fotos wurden mithilfe des Programms Adobe Photoshop Elements 2.0
zugeschnitten. Über die Funktionen Strg C, Strg N wurde das Bild kopiert und eine
neue Datei zur Bearbeitung erstellt. Über Strg V wurde das zugeschnittene Bild
eingefügt und über Strg E auf eine Ebene reduziert. Auf das Bild wurde eine Auto-
erstellte zu jedem Bild drei Ebenen. In Ebene 1 markierte man den linken Ventrikel
(LV) blau und sparte dabei Überreste des rechten Ventrikels, Gefäße oder
Seitenanschnitte aus. In Ebene 2 wurde die Area at risk (AAR), das von der Ischämie
betroffene Areal, mit rot markiert. Zur Area at risk zählten ziegelrot erscheinendes
Gewebe, sowie weißes infarziertes Gewebe. In Ebene 3 wurde das Infarktareal (IA),
Gebiete gepunktet.
25
Abbildung 4: Planimetrie der myokardialen Infarktgröße. Digitale Photographien einer
mittelventrikulären Scheibe nach Färbung mit Evans Blue und TTC. Infarzierte Areale
erscheinen weiß; noch vitales Gewebe innerhalb der Area at risk färbt sich ziegelrot;
A:Planimetrie des gesamten linken Ventrikels (blau); B: der Area at risk (rot); C: des
infarzierten Gewebes (gelb); D: Übersicht der 3 Markierungsebenen.
2.2.10 Berechnung der Area at risk (AAR) und Infarct size (IS)
Die Pixelwerte des LV, der AAR sowie des IA von der apikalen als auch basalen
Seite eines jeden Herzschnitts wurden in eine Exceltabelle übertragen. Zudem wurde
das Gewicht des jeweiligen Herzschnitts notiert. Aus diesen Werten ließ sich das
Gesamtgewicht des LV, der AAR, sowie des IAs berechnen. Die AAR in % wurde als
26
Sie gibt also das Ischämieareal in g an. Die IS in % errechnete sich aus dem
Verhältnis des Gesamtgewichts des IAs zum Gesamtgewicht der AAR. Analog zur
und mit oxygenierter KREBS Lösung (37°C; pH=7,4) perfundiert. Die Gefäße wurden
unter einem konstanten Druck von 45 mmHg äquilibriert. Alle Versuche folgten dem
gleichen Schema. Zwischen der Gabe verschiedener Agentien lag stets eine 40-
eine Messung des Lumens sowie der Wanddicke an drei verschiedenen Stellen des
daraus der Mittelwert berechnet. Zu Beginn des Versuchs wurde das Gefäßsegment
für 40 Minuten mit KREBS-Lösung gewaschen, damit sich das Endothel von den
Einflüssen der Präparation beruhigte. Danach folgte die Messung der Kontraktion der
glatten Muskulatur bei 10-5 mol/l Noradrenalin (NA) und anschließend die
Vasodilatation bei einer Acetylcholinkonzentration (ACh) von 10-4 mol/l. Damit sollte
27
für aufsteigende Konzentrationen von 10-9 bis 10-4 mol/l NA. Danach wurde nach
Gabe des NO-Synthase-Inhibitors L-Name in einer Konzentration von 10-5 mol/l. Der
NO-Synthase zu erzielen. Nach einer Vorkontraktion mit 10-5 mol/l NA wurde das
Segment erneut mit ACh in aufsteigenden Konzentrationen (10-10 bis 10-4 mol/l)
perfundiert und das vasodilatierte Lumen gemessen. Einer Ausspülphase mit KREBS
bestimmen.
2.3.2 Histologie
Zum Nachweis atherosklerotischer Veränderungen auf Zellebene wurden
histologische Schnitte der Aorta der LDLR-/- Mäuse angefertigt. Nach der
Herzentnahme (s. oben) wurde die Aorta entlang der Wirbelsäule freipräpariert,
exzidiert, halbiert und danach in Formalin (4%) fixiert. In der Pathologie des
dicken Schnitte wurden auf Objektträger aufgebracht und bei 60 °C zum Trocknen in
Eosin nach einem standardisierten Protokoll. Unter dem Lichtmikroskop wurde die
durchgeführt.
28
2.4 Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mithilfe von SPSS durchgeführt. Die gewonnenen
Daten werden in der vorliegenden Arbeit als Mittelwert +/- Standartabweichung des
Mittelwerts präsentiert und wurden mit dem Kruskal-Wallis- und Dunn’s-Test (RIPC
vs. APC vs. CON bei Wildtypmäusen) bzw. dem Mann-Whitney Test (RIPC vs. CON
29
3 Ergebnisse
Einhundertelf C57BL6N Mäuse wurden instrumentiert. Insgesamt 43 Tiere wurden
und zwei Mäuse keine ST-Hebung zeigten (2 CON). Bei 4 Tieren waren die
von weniger als 20 % führte bei 6 Mäusen der Kontrollgruppe ebenfalls zum
eine IS größer als 45 % zur Exklusion führt. Damit wurden 3 Tiere nicht in die
Insgesamt fünf Tiere schieden vorzeitig aufgrund einer Asystolie aus dem
Experiment aus (2 LDL-CON; 3 LDL-RIPC). Drei Tiere der LDL-CON wiesen eine IS
von weniger als 20 % auf, was zur Exklusion führte. Damit belief sich die
Versuchstiere.
Ischämie betroffene Areal betrug in allen drei Gruppen zwischen 30 % und 40 % (vgl.
Abb. 5). Sowohl APC als auch RIPC zeigten eine signifikante Reduktion der IS zur
Kontrollgruppe. Die IS in CON betrug 45,31 +/- 2,61 %. Die Applikation von
30
Sevofluran reduzierte die Herzinfarktgröße auf 27,11 +/- 3,44 % (p<0,05). RIPC
ergab eine IS von 23,74 +/- 4,31 % (p<0,05). Es konnte kein signifikanter
6).
31
Abbildung 6: Prozentualer Anteil der Herzinfarktgröße an der AAR;
Angegeben ist Mittelwert +/- SD. * Signifikant (p < 0,05) verschieden zu CON. CON =
Kontrollgruppe (n=25); APC = 1,0 MAC Sevofluran (n=11); RIPC = 3 x 5 min
Hinterlaufischämie (n=12).
zur AAR der ischämisch fernkonditionierten Mäuse (vgl. Abb. 7). Die
war signifikant kleiner verglichen zur Kontrollgruppe. Diese hatte eine Infarktgröße
32
Abbildung 7: Prozentualer Anteil der AAR am linken Ventrikel;
Angegeben sind Mittelwert +/- SD. LDL-CON = Kontrollgruppe der LDLR-/- Mäuse (n=3);
LDL-RIPC = 3 x 5 min Hinterlaufischämie bei LDLR-/- Mäusen (n=7).
33
3.3 Experimente zum Nachweis von Atherosklerose
Zwanzig LDLR-/- Mäuse erhielten über einen Zeitraum von 14 bis 16 Wochen
darzustellen.
Mesenterialgefäße der C57Bl6N Maus erreicht. Die Gefäße der LDLR-/- Mäuse sind
bei 10ˉ⁴ mol/l NA maximal kontrahiert (vgl. Abb. 9). Acetylcholin führt
am mit 10ˉ⁵ mol/l NA vorkontrahierten Lumen führt, liegt bei LDLR-/- Mäusen die
maximale Vasorelaxation bei 74,1 % des Ausgangswertes (vgl. Abb. 10). L-NAME
führt zu einer irreversiblen Hemmung der endothelialen Synthase. Die ACh induzierte
34
eNOS-Blocker abgeschwächt. Es wird eine Relaxation von 74,6 % des
% ohne L-NAME (vgl. Abb. 11). Eine Vorbehandlung mit L-NAME zeigt, dass unter
60,3 % vom Ausgangswert möglich ist. Die Wirkung von ACh an den unbehandelten
Mesenterialgefäßen von LDLR-/- Mäusen betrug 74,2 % (vgl. Abb. 12). S-Nitroprussid
Mesenterialgefäßen der C57Bl6N Maus als auch der LDLR-/- Mäuse wird bei einer
Konzentration von 10ˉ² mol/l SNP eine über 90 %ige Relaxation erreicht (vgl.
Abb.13).
35
Abbildung 11: Wirkung von ACh an mit L- Abbildung 12: Wirkung von ACh an mit L-
NAME inkubierten Mesenterialgefäßen im NAME inkubierten Mesenterialgefäßen im
Vergleich zu unbehandelten Vergleich zu unbehandelten
-/-
Mesenterialgefäßen einer C57Bl6N Maus Mesenterialgefäßen einer LDLR Maus
36
durch eine Pathologin ergab, dass sich in keinem der angefertigten Präparate
37
4 Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit soll die Hypothese getestet werden, dass Ischämische
Patienten im klinischen Setting nur begrenzt von der innovativen Methode (42–45).
Studien haben gezeigt, dass junge gesunde Versuchstiere einen größeren Nutzen
aus kardioprotektiven Anwendungen zogen, als ältere Tiere (86). Im klinischen Alltag
industrialisierten Welt stellt vor allem die Atherosklerose eine häufige und
kardioprotektiv wirkt, wird durch eine Studie von Redel et al. gestützt. Diese zeigten,
dass die Wirkung von Anästhetika induzierter Präkonditionierung mit Desfluran bei
minütiger Applikation von Desfluran signifikant von 50% auf 10% reduziert wurde,
ließ sich in eNOS-/- Mäusen der myokardiale Schaden nicht verringern (73). Man
nimmt an, dass die endotheliale Dysfunktion in hohem Maß an der Entstehung von
Synthase, ein Enzym, welches vornehmlich in den Endothelzellen exprimiert wird, ist
wirkt gefäßschützend. Über dessen vasodilatierende Wirkung ist es nicht nur an der
Regulation des Blutdrucks beteiligt, sondern beugt auch die Entstehung von
38
sowie die Expression pro-inflammatorischer atherosklerosefördernder Gene reduziert
Cofaktor, oxidiert. Dadurch wird die Reduktion von O₂ von der Stickstoffmonoxid-
endotheliale Dysfunktion vor (88). Die Untersuchungen von Redel et al. zeigen, dass
aufgehoben ist (73). Dies führt zur Hypothese dieser Arbeit, dass auch RIPC in
(91). Die Sicherung der Atemwege erfolgte im Rahmen dieser Studie anstelle einer
durchzuführen war. Der restliche operative Ablauf unterschied sich nicht von der
Vorlage. Die Koronarokklusion wurde mit über Metallstangen hängenden, mit 1ml
Vorteile gegenüber einer Okklusion mit zugezogenem Knoten, welcher zu Beginn der
Reperfusion wieder gelöst werden muss (92). Während eine Ligatur der linken
Koronararterie mittels Knoten ein hohes Risiko für Gewebeverletzungen mit sich
39
bringt und keine vollständige Unterbrechung des Blutflusses garantiert, kann die
ausgemessen und ausgewertet. Studien zeigen, dass eine doppelte Messung durch
und anschließender 3 stündiger Reperfusion die Applikation von 1,0 MAC Sevofluran
für 15 Minuten (11). Es zeigte sich, dass das volatile Anästhetikum die Infarktgröße
auf 27% und damit signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe senken konnte. Diese
Daten lassen sich mit denen von Redel et al. bestätigen, welcher durch Anwendung
von Sevofluran eine Infarktreduktion von 26 % erzielte (11). Die Reproduktion dieser
Hierzu wurde ein 3 ml Kryoröhrchen gekürzt und über den Hinterlauf gezogen.
Zwischen hinterer Extremität und Röhrchen wurde ein Tubus eingeführt dessen
Ballon mit einer Pumpe verbunden war. Der Ballon des Tubus wurde soweit
aufgepumpt bis der auf den Hinterlauf ausgeübte Druck die Durchblutung der A.
Ligatur (33) stellt diese Methode eine kostengünstige, nicht invasive und leicht
umsetzbare Alternative dar. Die Wahl des RIPC Zyklus basierte auf den
40
Versuchsprotokolle, welche bezüglich Zyklusanzahl und Ischämiedauer variierten,
vivo im Langendorff-Modell folgte. Deren Untersuchung ergab, dass vier bis sechs
RIPC Zyklen erzielt keine weitere Infarktreduktion. Die Variation der Dauer der
getestet wurde, ergab, dass Zyklen mit je zweiminütiger Ischämie die gleiche
Erkenntnisse wurde ein RIPC-Zyklus bestehend aus jeweils 5 Minuten Ischämie und
Indexischämie begann. Die Ergebnisse zeigen, dass RIPC eine im Vergleich zur
Kontrollgruppe signifikante Reduktion der IS auf 24 % bewirkt. Dies kann mit Daten
diesem Modell funktioniert und die Infarktgröße in dem Maß reduziert werden kann,
wie es durch die Applikation von Sevofluran möglich ist. Es besteht kein signifikanter
Mittelwerte der AAR von Kontrollgruppe, APC und RIPC zeigt, dass die Werte
zwischen 30% und 40% liegen und kein signifikanter Unterschied besteht. Hierzu
41
muss die linke Koronararterie stets auf ca. gleicher Höhe ligiert werden, was eine
verwendete man LDLR-/- Mäuse, welche über längere Zeit mit hochkalorischem
Futter ernährt wurden. Die Anwendung von RIPC ergab, dass die Infarktgröße in
LDLR-/- Mäusen verglichen mit der IS der LDLR-/- Kontrollgruppe um 80% und damit
signifikant gesenkt wurde. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zur Hypothese, dass
Versuchsergebnisse nahe, dass die Wirkung von RIPC nicht von einer endothelialen
Wildtyp-Tieren zeigten, blieben in eNOS-/- Mäusen aus (94). Geht man davon aus,
dass die Signaltransduktion von RIPC unabhängig vom Zielorgan gleich abläuft,
würde dies die Frage einer Umgehung der eNOS-Synthase aufwerfen. Auch die
(95,96). Stellt man die Hypothese auf, dass RIPC in eNOS-/- Mäusen, welche einen
42
IRS am Myokard erleiden nicht kardioprotektiv wirkt, müsste man anhand der
Erklärung für das Ergebnis dieser Studie wäre, dass keine bzw. noch keine
Annahme wird durch die Messungen am Myographen bestätigt. Zwar lässt sich
erkennen, dass die Vasodilatation bei den LDLR-/- Mäusen im Vergleich zu einer
gesunden C57Bl6N Maus leicht eingeschränkt ist, allerdings nicht in dem Maß, wie
eine Vasorelaxation um 89,2 %. In den LDLR-/- Mäusen betrug das Gefäßlumen 74,1
Die Wahl der LDLR-/- Mäuse sowie der proatherogenen Nahrung basierte auf den
6 %, Cholesterol: < 0,02%) milde Läsionen am Aortenstamm oder entlang der Aorta
(75). Ihr Cholesterolplasmaspiegel ist unter regulärer Nahrung doppelt so hoch wie
der einer C57Bl6N Maus, wobei Cholesterol vor allem in atherogenem LDL
gebunden ist und nur geringe Mengen an VLDL vorhanden sind. Auch das humane
alte Mäuse erhielten über einen Zeitraum von 28 Wochen eine mit Cholesterol
43
es unter „western-type diet“ beobachtet wurde, entwickelten. Trotz signifikant
waren die Tiere gesund und aktiv (82). Für die Untersuchungen dieser Studie war
dies ein wichtiges Kriterium, da mögliche Confounder, wie eine neu aufgetretene
Läsionen an der Aortenwurzel signifikant kleiner war verglichen mit Mäusen unter
beobachtet werden (82). Die Ergebnisse dieser Studie beruhen auf Nagern, welche
über 14 bis 16 Wochen eine vergleichbare Diät (Fett: 4,5%; Cholesterol: 1%)
erhielten. Die Mäuse waren darunter stets aktiv und gesund. In den mit HE gefärbten
hierfür wäre, dass die Mäuse zu früh getötet wurden. Unterschiede bezüglich des
Modells nach Hartvigsen bestehen insofern, dass die Mäuse dieser Studie zum
Zeitpunkt der Tötung maximal 24 Wochen alt waren, während sich die Versuchstiere
der Hartvigsenstudie in einem Alter von 42 Wochen befanden (82). LDLR-/- Mäuse
weisen unter Standartdiät auch nach 9 bis 12 Monaten nur minimal ausgeprägte
hochkalorischer Diät (Fett: 21%; Cholesterol: 0,15%) innerhalb von 0 bis 3 Monaten
erste Läsionen im Bereich des Aortensinus, des Aortenbogens und des Truncus
brachiocephalicus nachweisbar waren (100). Zwar erhielten die Tiere dieser Studie
eine Diät mit deutlich geringerem Fettgehalt. Allerdings ist es wahrscheinlich, dass
44
im Bereich des Aortensinus vorlagen. Allerdings müssen diese Veränderungen noch
waren. Demzufolge wäre das Ergebnis der RIPC in LDLR-/- Mäusen nicht
type“ ähnliche Nahrung zwar schneller proatherogen wirkt, aber auch zahlreiche
Begleiterkrankungen der Tiere mit sich bringt, die die Ergebnisse verfälschen
können. Eine weitere Möglichkeit wäre die Verwendung von apoE-/- Mäusen, da
aufweisen (79). Eines der Hauptmerkmale der humanen Atherosklerose ist deren
Lokalisation unter anderem in den Koronararterien und damit die Entstehung des
45
Atherosklerosemodells sollte außerdem die kardioprotektive Wirkung des
Begleiterkrankung zu treffen.
46
5 Zusammenfassung
Ischämische Fernkonditionierung bedeutet, dass eine Ischämie eines „entfernten“
Ein Vergleich der Ergebnisse dieser Arbeit mit Resultaten einer Präkonditionierung
Unterschied. Dies zeigt, dass es sich bei RIPC um eine vielversprechende Form der
Präkonditionierung handelt.
der westlichen Bevölkerung dar. Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit, die
Mäuse, welche über einen Zeitraum von 14 bis 16 Wochen mit cholesterolhaltiger
Veränderungen. Die Versuche ergaben, dass mittels RIPC eine zur Kontrollgruppe
signifikante Reduktion des Infarktareals erlangt wurde. Die zum Nachweis der
Myograph Anzeichen einer eingeschränkten eNOS vermuten ließ, zeigten sich in den
47
Prozesse. Um eine absolute Aussage zur Wirkung von RIPC in mit Atherosklerose
erkrankten Tieren treffen zu könne, sollte ein Modell mit stärker ausgeprägten
erforschen, ob eine bestehende endotheliale Dysfunktion, wie sie auch bei der
Entstehung von Atherosklerose beteiligt ist, Einfluss auf die Wirkung der
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich bei RIPC um eine potente Form
der Konditionierung handelt, die bei Übertragung ins geeignete klinische Umfeld
48
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57
Anhang
Geräte
Produktname Bezugsquelle/Hersteller
OP-Besteck
Produktname Bezugsquelle/Hersteller
Castroviejp with Tungsten Carbide Jaws,
Fine Science Tools (FST)
No. 12565-14
Chirurg. Schere, BC325R Medika Medizintechnik GmbH
Doppelelevatorium n. Freer halbscharf
Medika Medizintechnik GmbH
und stumpf, 20cm
Dumont#5, No. 11251-20 FST
Andere Materialien
Produktname Bezugsquelle/Hersteller
Ein recht herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn PD. Dr. A. Redel für die
Bollwein und dem Leiter des Labors Herrn Dr. Michael Gruber für die hervorragende
Hilfsbereitschaft im Laboralltag.
Bedanken möchte ich mich außerdem bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von
Der herzlichste Dank gilt meinen Eltern Michaela und Martin Eglmeier, welche mir
dieses Studium ermöglicht haben und mich während dieser Zeit stets unterstützt
haben.
Ich bestätige, dass ich die vorliegende Doktorarbeit alleine und ohne fremde Hilfe
erstellt habe.
Kathrin Eglmeier
Lebenslauf
Geburtsdatum: 20.02.1993
Familienstand: Ledig
Schulausbildung
Universitäre Ausbildung
Regensburg
Kathrin Eglmeier