Crecimiento Microbiano
Crecimiento Microbiano
Crecimiento Microbiano
CRECIMIENTO CELULAR
CRECIMIENTO CELULAR
Los microorganismos en un medio de cultivo apropiado, se dividen
empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para
producir nuevos microorganismos.
Este proceso contina hasta que algn nutriente del medio de
cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene.
Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos
Hay tres aspectos determinantes del crecimiento microbiano:
Los factores del crecimiento.
El estequiomtrico, por el cual la concentracin final de
microorganismos obtenidos depender de la concentracin y
composicin del medio de cultivo
El cintico, que indica la velocidad del proceso.
Temperatura
pH
Actividad de Agua
Presin Osmtica
1.a.- Temperatura
Cada microorganismo prefiere una T de desarrollo.
Temperatura mnima, por debajo ella que no hay crecimiento
La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a:
Reduccin en la velocidad de reaccin (segn leyes cinticas)
Cambio de estado de los lpidos. (aumento de viscosidad)
Temperatura ptima a la que la velocidad es mxima.
El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura
se debe al incremento generalizado de la velocidad de las
reacciones enzimticas con la temperatura.
. Temperatura mxima por encima de ella no hay crecimiento
Tipos microbianos
Sicrfilos: -5 20C, ptimo < 15oC
organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis (nieve rosada),
bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium
membrana con alto % de c. grasos insaturados
Psicrtrofos 0-35C, ptimo 20-30oC
Pseudomonas - crecen en el refrigerador
( psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas, es
importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran
contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de
refrigeracin (4 - 8C) y de producir infecciones en los consumidores del
alimento (30 - 35 C).
Mesfilos 15-45 C, ptimo: 30-40C
Mayora de los m.o (del suelo, aguas, patgenos)
Termfilos 40-70C, ptimo de 55-65oC Tienen membrana con alto % de
cidos grasos saturados, y enzimas estables al calor
Bacillus stearothermophilus, (compostaje)
Hipertermfilos 80-113C, ptimo > 90o Pyrococcus, Pyrodictium (aguas
termales)
1.b.- pH
El pH interno en la mayora de m.o. est en 6.0 a 7.0.
Los rangos de pH tolerables son distintos.
Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y alcalfilos que
toleran pH=10.0
Como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele bajar.
Si la nica fuente de nitrgeno es
amonio, se produce liberacin de iones H,
bajando el pH.
Si la fuente de nitrgeno es solo nitrato,
se deben tomar iones H del medio para
formar amonio, subiendo el pH.
V . = R . T . Ln.aw
donde
R es la constante de los gases,
T la temperatura absoluta,
la presin osmtica,
V el volumen molar parcial del agua
Puede definirse como la presin que se
debe aplicar a una solucin para
detener el flujo neto de disolvente a
travs de una membrana
semipermeable.
La Presin osmtica alta, causa prdida
de agua y plasmlisis celular.
Fase de latencia
Cuando se introduce un inoculo en medio fresco, el crecimiento
usualmente no comienza de inmediato sino despus de un tiempo
llamado de latencia o acostumbramiento.
En este periodo de transicin los microorganismos, producen las
enzimas necesarias para aprovechar un nuevo medio ambiente.
En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas, pero hay
actividad metablica, aumento en el tamao individual de las clulas,
en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas.
Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al
mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento,
no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la
misma velocidad.
Si una poblacin se transfiere de un medio de cultivo rico a un
medio pobre, se observa latencia porque las clulas para poder
seguir creciendo deben tener las enzimas necesarias para sintetizar
algunos metabolitos esenciales que no estn presentes en el medio.
Fase de muerte
Ocurre una disminucin progresiva en el nmero de clulas
viables.
velocidad de muerte celular > velocidad de divisin celular
Cuando la concentracin de sustrato es mnima, la clula se ve
forzada a metabolizar su propio protoplasma (se conoce como
metabolismo endgeno)
Manejo industrial.
La fase de latencia, no es deseable, por que se pierde tiempo y
acarrea prdidas econmicas
Para minimizar esta fase, se hace crecer el inculo aparte, en un
medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso
(cultivo o fermentacin) y luego se procede a transferirlo cuando
las clulas ya se encuentran en la fase exponencial (inoculacin).
Proceso semicontinuo
Se evitan las fases de adaptacin y decaimiento.
Criterios:
mantener la concentracin de sustrato suficientemente alta para
evitar escases.
la concentracin del producto suficientemente baja para no
sobrepasar los lmites tolerables.
Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas
alcohlicas, de antibiticos, de aminocidos, etc)
Su aplicacin ms conocida es para la depuracin de aguas
residuales, por procesos aerbicos o anaerbicos.
El medio de cultivo fresco es el agua residual que entra en la
planta y alimenta a los fangos activados por MO que luego se
retiran por decantacin
3.- DETERMINACION DE LA
CONCENTRACION CELULAR
Existen diversos mtodos, con diferentes propuestas de
clasificacin.
Se pueden agrupar en dos:
mtodos directos y
mtodos indirectos.
Directos obtienen una medida de la masa celular por:
Tcnicas de conteo,
Medida de concentracin de masa celular: peso celular,
absorbancia.
Indirectos miden la concentracin de algn componente celular
(ADN, protenas, etc).
a. Conteo celular
Se cuentan directamente las clulas, determinando la masa celular
por unidad de volumen.
En el mtodo la suspensin de la muestra se coloca en una cmara
de recuento en una cuadriculada de dimensiones conocidas, y se
tapa con el cubre objetos. Como se conoce el rea de las cuadrculas
y la altura de la cmara de recuento, el volumen ocupado por la
suspensin en cada cuadrculas queda determinado.
Para obtener el nmero de bacterias por mililitro de suspensin, se
requiere
contar el nmero de microorganismos en varias
cuadriculas, calcular el promedio de recuento por cuadrcula y
multiplicar este promedio por el factor correspondiente.
Estos mtodos presentan algunas limitaciones:
- No se pueden distinguir clulas vivas de clulas muertas.
-Las clulas muy pequeas son difciles de contar.
-La precisin es difcil de lograr
-El mtodo no es adecuado para suspensiones celulares de
baja densidad, es decir las soluciones deben contener
aproximadamente 107 clulas/mL o ms.
Cmaras de recuento
Existen cmaras especificas como: Cmaras de Neubauer, Cmara
de Petroff-Hausser, el hemocitmetro, Microscopio graduado de
Helber, etc.
Cmara de Neubauer.
Esta cmara est adaptada al microscopio de campo claro o al de
contraste de fases
Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente
deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrcula de dimensiones conocidas.
Se cubre la cmara con un cubreobjetos que se adhiere por simple
tensin superficial (en especial una vez que se haya aadido la
muestra lquida).
Cuadrado de 3 x 3 mm.
El rea sombreada y marcada L es 1
mm2.
La depresin tiene 0.1 mm de
profundidad.
El volumen de la superficie L, bajo el
cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1
microlitro)
Los cuadrados L estn subdivididos en
16 cuadraditos de 0,0025 mm2 cada
uno.
El cuadrado del centro est dividido en
5 cuadrados por lado con una longitud
lateral de 0,2 mm, y superficie de 0,04
mm2.
Al contar las cuatro reas sombreadas
(L), si hay un total de x clulas entre las
cuatro reas, la concentracin en la
suspensin celular ser :
Cmara de Neubauer
Tcnica de conteo
Para que las clulas, no se
cuenten dos veces, reglas:
Cmara Petroff-Hausser
El retculo del fondo est
dividido en 25 cuadrados
grandes
Cada cuadrado grande tiene
16 cuadraditos
Volumen de la cmara= 0,02
mm3
rea de la cmara 1 mm2
b) Equipos automticos
"Cell Coulter" de Beckman-Coulter
Se basa en medir los cambios en la resistencia
elctrica que se producen cuando una partcula
no conductora en suspensin en un electrolito
atraviesa un pequeo orificio.
El contador consta de dos cmaras separadas
por un material no conductor, en el que hay un
orificio de tamao similar al de las clulas.
Cada cmara contiene un electrodo, la
suspensin de clulas a ser contadas se coloca
en una de las cmaras y se aplica presin para
que las clulas pasen a la otra cmara a travs
del orificio, cada vez que una clula pasa a travs
del orificio ocasiona un cambio en la
conductividad elctrica que es registrado por un
dispositivo electrnico y de esta manera el
contador indica el nmero de clulas en esa
suspensin.
6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)
1 mL de inculo
0,1 mL de inculo
3 tubos positivos
1 tubos positivos
Tabla: NMP de
bacterias por 100
g (ml) de material
analizado
empleando cinco
tubos inoculados
con 10, 1 y 0.1 ml
o g de material
Tsoumada de:
Enumeration of coliforms,
faecal coliforms and of e.
Coli in foods using the
MPN methoD MFHPB-19
April 2002 por Donna
Christensen Crawford y
Rick Szabo
Uso de la tabla
Consideremos positivos los siguientes cultivos:
(1) 5 tubos inoculados con 10 ml de la dilucin (1/10) del material :
los cinco (5) son postivos
(2) 5 tubos inoculados con 1 ml de la dilucin (1/10) del material:
solo uno (1)es positivo
(3) 5 tubos inoculados con 0,1 ml de la dilucin (1/100) del material:
ninguno (0) es positivo
Cada uno de los cinco tubos de las tres diluciones representan
respectivamente a 1, 0.1 y 0.01 g (ml), del material analizado.
La lectura se toma en la ubicacin de la Tabla correspondiente a la
lectura 5-1-0 (NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml)
de material.
Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas
con las que se construy la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse
por 10, lo que proporciona un valor de 330 organismos por 100 g
(ml) de material.
Como usualmente se expresa por g (ml) de material, este valor
(330) debe dividirse por 100.
El recuento obtenido por el NMP es en este caso de 3,3 organismos
por g (ml) de material analizado.
d. Peso seco.
Se basa en secar volmenes conocidos de medio con las
clulas en crecimiento, hasta obtener un peso constante.
Es til para grandes volmenes.
Para levadura se puede usar una centrfuga con velocidades
de 4-6x103rpm. Se obtiene una masa hmeda de clulas, luego
esta masa se lava y seca a 80C por 24 horas, y se pesa.
En clulas bacterianas, se usan filtros de membranas para
obtener la masa celular hmeda, y luego se seca.
(1 mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de
5 x 10 9 bacterias)
Puede ser usada cuando el medio no contiene slidos en
suspensin.
Desventajas:
Los componentes voltiles de la clula pueden perderse.
La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado,
principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
Requiere muestras muy grandes y el proceso es lentos.
e. Absorcin de luz.
Consiste en hacer incidir una luz monocromtica a la suspensin
de microorganismos, y se mide la luz transmitida a travs de la
suspensin, la que es inversamente proporcional a la
concentracin de biomasa, segn la ley de Beer.
Usar, turbidmetro o espectrofotmetro 600- 700 nm.
Se necesitan de 10 millones a 100 millones de clulas por mililitro
para hacer una suspensin suficientemente turbia para ser leda.
e. Absorcin de luz.
Hay que hacer una curva de
calibracin que relacione
medidas directas (recuento en
placa o microscopa) con las
indirectas de turbidez
Teniendo esta curva, se podr
determinar las ufc/ml de otras
muestras luego de leer la
absorbancia de las mismas.
Valores altos de OD (mayores a
0.3) afectarn la linealidad en la
respuesta.
El principal inconveniente es
que no distingue clulas vivas
de muertas, o entre clulas y
otras particulas. Sin embargo, es
una tcnica que puede ser
utilizada on-line para
mediciones continuas
g. Efectos fsicos.
Se puede medir la variacin de algn factor
externo por efecto del crecimiento celular, tales
como;
X = 2nXo , Y =2n.Xo
Aplicando logaritmos: X = 2n Xo
(2)
(3)
Medio
Tiempo de generacion
(min)
E. Coli
Glucosa-sal
17
Bacillus megaterium
Sacarosa-sal
25
Streptococcus lactis
Leche
26
Staphylococcus aureum
27-30
Streptococcus lactis
Caldo lactosa
48
Lactobacillus acidfulus
Leche
66-87
Rhizobium japonicum
Leche
344-461
Mycobacterium
tuberculosis
Sinttico
792-932
Ejemplo.1
Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo ptimo y
despus de 4 horas de incubacin, creciendo exponencialmente,
se obtienen 100 000 bacterias. Calcule el tiempo de generacin.
Xo = 1000
X = 100 000
T = 4 horas =240 minutos
g =? g = t/n
Clculo de n de la ec (3):
n = 3.3 log X/Xo , n = 3.3 log 100000/1000 = 6.6 generaciones
g =t / n
g = 240/6.6 = 36,36 minutos
Otra forma: con g =0.693 t / (lnX - lnXo)
g= (0.693 x 4) / (ln100) = 0.602 hr = 36.12 min
Ejemplo 2.
En un cultivo se tiene inicialmente 5x107 bacterias y despus de 6
horas se tiene 5x108 Calcule el tiempo de generacin
Ecuaciones:
n=t/g, : n= (LnX-LnXo)/Ln2
Reemplazando:
n = (20-17.7)/0.693
n = 3.3
g = t/3.3 = 6/3.3
g =Td = 1,8 h
Ejemplo 3.
En un proceso de fermentacin microbiana, se toman datos del
conteo celular, obtenindose los siguientes:
t (hr)
X
0 0.5
1
2
1
4
1.5 2
8 16
2.5
32
3 3.5
4 4.5
5 5.5
6
6.5
7
64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16382
0 0.5
1
1
2
4
0 0.7 1.4
1.5
8
2.1
2
16
3
2.5
3
32
64
3.47 4.16
3.5
128
4.9
4
256
5.5
4.5
5
5.5
6
512 1024 2048 4096
6.2 6.93 7.62 8.32
6.5
7
8192 16382
9.01 9.704
Solucin Grfica:
(criterio)
La pendiente de la
lnea de ajuste
corresponde a la
variacin del doble
del valor de X en la
ordenada y de un
valor g en la abscisa.
Por tanto: m=Ln2/g
(8)
rx = X
(9)
5.- ESTEQUIOMETRIA
Estudia el grado en que un microorganismo puede
transformar los componentes del medio de cultivo en nuevas
clulas (biomasa) y productos.
Esto determina la viabilidad de un proceso industrial.
balance de materiales.
los coeficientes de rendimiento.
Yx/s= -X/S
(5)
Yx/s = - rx/rsu
rx = -Yx/s . rsu
(6)
Sustrato
Enterobacteraergenes
Yx/s
Yx/o2
g/g
g/mol
g/g-C
g/g
Maltosa
0.46
149.2
1.03
1.50
Manitol
0.52
95.2
1.32
1.18
Fructosa
0.42
76.1
1.05
1.46
Glucosa
0.40
72.7
1.01
1.11
Candida utilis
Glucosa
0.51
91.8
1.28
1.32
Penicillium chrysogenum
glucosa
0.43
77.4
1.08
1.35
Pseudomonas fluorescens
glucosa
0.38
68.4
0.95
0.85
Rhodopseudomonas spheroides
glucosa
0.45
81.0
1.12
1.46
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa
0.50
90.0
1.25
0.97
Enterobacter aergenes
Ribosa
0.35
53.2
0.88
0.98
Succinato
0.25
29.7
0.62
0.62
Glycerol
0.45
41.8
1.16
0.97
Lactato
0.18
16.6
0.46
0.37
Piruvato
0.20
17.9
0.49
0.48
Acetato
0.18
10.5
0.43
0.31
Sustrato
Yx/s
Yx/o2
g/g
g/mol
g/g
g/mol
Cndida utilis
Acetato
0.36
21.0
0.90
0.70
Pseudomonas fluorescens
Acetato
0.28
16.8
0.70
0.46
Cndida utilis
Etanol
0.68
31.2
1.30
0.61
Pseudomonas fluorescens
Etanol
0.49
22.5
0.93
0.42
Klesbiella sp.
Metanol
0.38
12.2
1.01
0.56
Metylomonas sp.
Metanol
0.48
15.4
1.28
0.53
Pseudomonas sp.
Metanol
0.41
13.1
1.09
0.44
Metyloccocus sp.
Metano
1.01
16.2
1.34
0.29
Pseudomonas sp.
Metano
0.80
12.8
1.06
0.20
Metanol
0.60
9.60
0.80
0.19
Metano
0.56
9.00
0.75
0.17
Pseudomonas metnica
s = sx + sp + sE
Donde:
(8)
rg= -Yrsu
Y=Coeficiente de mximo rendimiento medido durante un periodo finito en la fase
de crecimiento logartmico. Se define como la masa de clulas formadas/masa de
sustrato consumidos.
Calculo directo de
Por balance elemental de C, H, O y N se tiene:
(7)
(8)
(9)
Para: NH3 , H2O y C02 es = 0. Adems el grado de reduccin del
O2 es -4.
Reordenando la ecuacin (9) queda:
(10)
O bien:
(11)
Ejemplo 1:
Se cultiv la levadura Candida utilis en un medio conteniendo
glucosa, S04(NH4)2 y sales. La concentracin inicial de
microorganismos fue de 0.53 gL-1, y la glucosa 15.2 gL-1. Al cabo de
9.5 horas, se consumi totalmente la glucosa, se consumieron 0.123
mol de O2 L-1, se produjeron 0.179 mol de CO2 L-1 y la biomasa
alcanz un valor de 6.07 gL-1. Se desea averiguar si, adems de
biomasa, se form algn producto.
Datos:
Xo = 0.53g/L , So= 15.2 g/L
t= 9.5 hr.
Sf= 0, Xf= 6.07 g/L
consumo: O2= 0.123 mol/L
Productos: CO2= 0.179 mol/L .
Criterios de solucin: se usa formula de microorganismo promedio,
y el valor de C-mol.
Ejemplo 1:
Ecuacin de reaccin:
No estructurados
No segregados
CAJA NEGRA
Segregados
estructurados
CASO REAL
Modelo de Monod
Monod en 1942 desarroll una ecuacin cintica simple.
Parte de suponer que slo una enzima con cintica Michaeliana es la
responsable del consumo de S.
El modelo asume tambin que la produccin de biomasa depende
exclusivamente de la concentracin de un sustrato limitante.
Representacin:
Modelo de Monod
X : Concentracin de microorganismos.
: tasa efectiva de crecimiento K S
S : Concentracin de substrato, mg/L
m : tasa mxima de crecimiento
Ks : Constante de saturacin. Relacin inversa con afinidad del m.o
por el sustrato. L valor de S cuando = m/2
Cuando S > > Ks, toma el valor de m y rx slo depende de x.
En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mg/l.
En promedio:
En bacterias m
Las levaduras
Los hongos filamentosos
0.9 h-1
0.45 h-1
0.25 h-1
Modelo de Monod
= (dX/dt) = dX
(dS/dt)
dS
Modelo de Monod
m S
K sx x [S ]
Ejemplo
Una cultivo de microorganismos BATCH en crecimiento,
en sustrato de glucosa, dio los siguientes datos.
TIEMPO
(h)
ln X
CONC. GLUCOSA
(g/l)
1.25
0.2231
100.00
2.45
0.8961
97.00
16
5.10
1.6292
90.40
23
10.50
2.3514
76.90
30
22.00
3.0910
48.10
34
33.00
3.4965
20.60
36
37.50
3.6243
9.38
40
41.00
3.7136
0.63
ln X
ln X
t (h)
y ln X
tg m
x
t
b) Rpta.
ln 37.5 ln 5.1
m
0.1 h 1
36 16
X celuar
Rango de Conc. Celular
S sustrato
Rango de Conc. Sustrato
41 1.25
y
0.40 gr de clulas / gr de sustrato
0.63 100
c) Rpta.
X max X 0 Y .S 0
X max 1.25 0.4(150)
X max 60.25
g clulas
lt
Modelo logistico
Los modelos anteriores representan el comportamiento de los
m.o, slo en la fase log de un cultivo batch (donde es
constante)
Si se quiere representar todo el proceso, es necesario recurrir
al modelo logstico.
Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal
Se obtiene combinando la ecuacin de Monod con la
expresin de y la de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).
dX = m(Yx/s.So + Xo X) . X
dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)22
Modelos Estructurados
Los modelos estructurados modelan a la clula como un
sistema de componentes mltiples (ribosomas, enzimas,
membranas,etc.), y esta se describen con ms de una
variable.
En estos modelos, los componentes de la biomasa se
juntan en algunas variables clave que son representativas
del comportamiento celular.
La actividad microbiana es funcin de variables abiticas y
de la composicin celular, adems la actividad microbiana
depende de las condiciones ambientales que el cultivo ha
sufrido en el pasado.
Estos modelos tienen mayor capacidad de prediccin que
los modelos no-estructurados
Modelos estructurados.
Al construir el modelo se debe decidir cuantos componentes
celulares se tomaran en cuenta. (de 2 a 40)
Estos modelos consideran: las concentraciones intrnsecas,
(cantidad de un componente por unidad de masa celular) (Ci/X), y
las concentraciones extrnsecas o cantidad de un componente por
unidad de volumen del reactor.
d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)
dt
X.dt
X. X
Un resultado aceptable se produce usando al menos 3
componentes celulares.
Con mas componentes el modelo ser mas preciso, pero tambin
mas complejo.
Ci, es la concentracin de cada componente.
Modelos estructurados.
Con ms de un substrato limitante se pueden usar modelos
modelos multiplicativos, modelos aditivos y modelos
nominativos
Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-Kargi.
El modelo aditivo toma la forma:
Modelos segregados
Los modelos segregados tienen en cuenta que la poblacin
celular es heterognea, reconoce a las clulas como discretas,
por lo que resultan complejos.
Estos modelos pueden reconocer como diferentes a las
"clulas ms viejas" de las "clulas ms jvenes".
Se aplican a sistemas microbianos en los cules se observa
que la diferenciacin de las clulas juega un papel importante
en el desempeo global del cultivo, y que las cinticas de
crecimiento y la productividad del cultivo son afectadas por la
aparicin de ms de un tipo de clula. (Paz Astudillo)