UNIVERSIDAD VERACRUZANA Unidad de Apoyo en Resolucin Analtica (SARA)

Protocolo de investigacin del proyecto:

EVALUACIN DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE Y ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE LOS EXTRACTOS DE Salvia purpurea

PRESENTA

QFB. Ral Velasco Azorsa

DIRECCIN DE: Dra. Rosa Virginia Garca Rodrguez Xalapa Veracruz. 12 de Febrero del 2014

ndice
I. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 3
PLANTAS MEDICINALES ....................................................................................................................... 3 GENERO SALVIA....................................................................................................................................... 3 FITOQUMICA DEL GENERO SALVIA ................................................................................................. 4 PLANTA DE ESTUDIO ............................................................................................................................. 5

II. JUSTIFICACIN DEL ESTUDIO.............................................................................................. 7 III. HIPTESIS................................................................................................................................. 7 IV. OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................... 7 V. MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................................... 7
Colecta y Obtencin de los Extractos ............................................................................................... 7 Anlisis Fitoqumico .............................................................................................................................. 8 Determinacin del Potencial Antioxidante in vitro ................................................................... 8 a) Determinacin de la Capacidad Antioxidante mediante la Captura de Radicales Libres con el uso de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). ...................................................... 8 b) Determinacin del Contenido Total de Polifenoles. ............................................................. 9 c) Determinacin de la Capacidad Antioxidante mediante el Poder Reductor de Hierro, FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) .................................................................. 9 Determinacin de la actividad biolgica in vivo ......................................................................... 9 Determinacin de la Actividad Antiinflamatoria ........................................................................ 9 Edema inducido en oreja de ratn por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). ... 9 Induccin de edema por carragenina en la pata de ratn (subplantar).......................... 10 Determinacin de la Actividad Analgsica ................................................................................. 10 Contorsiones inducidas por cido actico. ................................................................................. 10 Hotplate................................................................................................................................................... 11 Estadstica .............................................................................................................................................. 11 OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................................................................. 7

VI. CRONOGRAMA: ..................................................................................................................... 11 VII. REFERENCIAS ...................................................................................................................... 11

I. ANTECEDENTES PLANTAS MEDICINALES Las plantas medicinales, son consideradas como aquellas especies vegetales que poseen propiedades teraputicas; han sido utilizadas desde los inicios de la civilizacin humana para el tratamiento de diferentes enfermedades y su empleo tambin ha servido como estrategia para la promocin de la salud humana que ha demostrado que su incremento en recientes aos. Este hecho, justifica su empleo porque estas especies vegetales poseen caractersticas como seguridad, efectividad y un mejor control de calidad en el diseo de fitomedicamentos, que se encuentran disponibles en el mercado actualmente. Una significante porcin de los medicamentos considerados como bsicos segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), son obtenidos de estas plantas, as como los medicamentos sintticos son en base a modelos de productos naturales. Por otro lado, el potencial de la biodiversidad es un gran recurso para nuevas drogas y medicamentos que es inexplorado, pues existen alrededor de 250,000-300,000 especies y menos del 10% ha sido investigado en relacin a su perfil qumico, farmacolgico y biolgico. Aunque recientemente, existe un notable progreso en el desarrollo de terapias naturales, por lo que es urgente la necesidad de descubrir agentes analgsicos efectivos y potentes. (De Souza et al., 2009). GENERO SALVIA El gnero de la salvia es muy amplio, incluye aproximadamente 900 especies de las que en Mxico existen al menos 200 especies segn describi Carl Epling (1939)1. pertenece al orden Lamiales, a la familia Lamiaceae y a la subfamilia Lamioideas, distribuida por todo el mundo. Se trata de plantas herbceas con tallos tetrgonos, hojas simples, opuestas y decusadas carentes de estpulas y flores en inflorescencias bracteadas, cimosas o racemosas. Las flores son zigomorfas y pentmeras con cliz bilabiado persistente con 5 spalos parcialmente soldados en una estructura tubulosa. La corola est constituida por 5 ptalos soldados. Por lo general, son plantas muy aromticas, muchas de ellas aclimatadas a los pases mediterrneos. Algunas especies pertenecientes a este gnero tienen inters en jardinera como ornamentales. La especie oficinal (Salvia officinalis L.) es de origen mediterrneo, donde crece de forma espontnea y se cultiva principalmente sobre suelos calcreos. (Ortega et al., 2002). Ver figura 1.9.

Carl Epling en 1939 describi 200 especies mexicanas del gnero Salvia, aunque las clasific en el gnero Calosphacea. que es un subgnero totalmente americano. 3

FITOQUMICA DEL GENERO SALVIA Los estudios fitoquimicos realizados a las Salvias mexicanas pertenecientes a la seccin Erythrostachys muestran que contienen metabolitos secundarios como quinonas diterpnicas cuya estructura qumica es similar a la de los diterpenos comnmente aislados de Salvias mexicanas estudiadas hasta el momento. (Spanos y Wrosltad, 1990). El estudio quimiotaxonomico de las especies de Salvias especficamente las pertenecientes al subgnero Calosphace, ha demostrado una relacin cercana entre el contenido de diterpenos de las especies estudiadas y el subgnero al cual pertenecen. El estudio fitoqumico de las partes areas de diversas especies, ha llevado la identificacin de muchas estructuras como las flavonas, triterpenos y esterloes. (Hernadez Ortiz, 1986).Todas las salvias presentan una composicin qumica compleja con abundantes metabolitos de naturaleza terpnica: monoterpenos y sesquiterpenos constitutivos de sus aceites esenciales, diterpenos (carnosol, rosmanol, epirrosmanol, cido carnsico) y triterpenos derivados del ursano y oleanano. Adems poseen abundantes compuestos fenlicos: flavonoides con sustituyentes sobre el C-6 y cidos fenlicos, principalmente cido rosmarnico.
1 HO OH O O HO OH HO 2 O CH3 OH O CH3

HO

H3C

CH3

Componentes qumicos del gnero Salvia: 1) cido rosmrico, 2) carnosol (terpeno).

ACTIVIDAD BIOLGICA DEL GENERO SALVIA

Varias especies del gnero Salvia, han reportado actividad antibacterial,

estrognica,

antioxidante y antitumoral; que son usadas para tratamientos de eccesema, psoriasis y tuberculosis. (Meshkatalsadatl et al., 2009). Estudios realizados en animales de experimentacin (leon de cobaya) han demostrado la actividad espasmoltica del aceite esencial quizs debido a la presencia

de alcanfor y acetato de bornilo. Por otra parte, el extracto hidroalcohlico es capaz de inhibir las contracciones inducidas por serotonina y acetilcolina, que se debe al efecto a los compuestos fenlicos (Newall et al., 1996) y en modelos animales se ha comprobado la actividad antiinflamatoria adems la aplicacin tpica de los extractos hexnico y clorofrmico redujo significativamente el edema inducido por aceite de croton en oreja de ratn y resultan inactivos tanto el extracto metanlico como el aceite esencial. Esta actividad antiinflamatoria parece estar relacionada con la presencia en los extractos de componentes triterpnicos como el cido urslico. (Baricevic et al, 2001) .
CH3 H3C

O CH3 CH3 OH CH3 HO H3C CH3

cido urslico PLANTA DE ESTUDIO Salvia purpurea.

Planta de Salvia purpurea

Se conoce como hierba sacra, alcanza hasta 2 metros de altura, menos en anchura, con hojas amarillo-verdes aovadas con orillas serradas. Las florescencias empiezan parecer en el medio del otoo con la planta que florece en el invierno. Las flores son de color prpura a rosa, estn en espigas terminales, del color intenso, tubulares y pequeas (1 cm). Las flores son empacadas apretadamente floreando a finales de muchas ramas. Algunos de sus componentes se han descrito con propiedades contra afecciones respiratorias, cicatrizante, dolencias del aparato digestivo y Contribuye a la hipoglucemia por lo que es beneficiosa para personas con diabetes y muy apreciada en gastronoma. (Lemes-Hernndez et al., 2000). Las partes tiles por la accin teraputica de Salvia purpurea son las hojas. En este caso, estas son ideales para aliviar dolores de garganta a travs de grgaras con la infusin de la planta. Tambin ayudan a calmar los trastornos comunes de la menopausia. Las hojas frescas por su parte, ayudan a estimular el aparato digestivo. Por otro lado, la raz se emplea para estimular el sistema circulatorio cuando se padecen dolores menstruales y problemas cardacos. Actuando como sedante y refrescante, ayuda a mejorar el estado del corazn y del hgado. (Jermain et al., 2009).

II. JUSTIFICACIN DEL ESTUDIO El estudio de las potencialidades reales de especies de plantas medicinales resulta prioritario para la conservacin de este recurso y permite dar las bases para estudios de futuras propuestas, como posibles fitomedicamentos, as mismo considerando estudios previos del gnero Salvia, que han demostrado que sus extractos poseen propiedades teraputicas debido a la presencia de compuestos terpnicos (C10, C15 y C30) y polifenlicos, los extractos orgnicos de hexano, cloroformo y etanol de Salvia purpurea, resultan ser una nueva fuente para la investigacin de propiedades tales como antioxidante, antiinflamatoria y analgsica. III. HIPTESIS Los extractos hexnico, clorofrmico y etanlico que se obtendrn de la planta Salvia purpurea tendrn la potencialidad de inhibir procesos inflamatorios y cuados de dolor agudo en diversos modelos experimentales in vivo. El efecto biolgico principal estar relacionado directamente con su composicin fitoqumica y una posible inhibicin de radicales libres determinadas por pruebas analticas. IV. OBJETIVO GENERAL Evaluar el potencial antioxidante y actividad antinflamatoria in vitro de extractos hexnico, clorofrmico y etanlico de Salvia purpurea. OBJETIVOS PARTICULARES I. Determinar la familia de compuestos presente en cada extracto.

II.

Determinar el potencial antioxidante de los extractos orgnicos

III.

Evaluar la actividad antiinflamatoria de los extractos orgnicos .

IV.

Evaluar la actividad analgsica del extracto ms activo del en ensayo antiinflamatorio.

V. MATERIALES Y MTODOS Colecta y Obtencin de los Extractos

La colecta se realizar en la poca de floracin de la especie a estudiar y un espcimen de la planta se depositar en el Herbario del Centro de Investigaciones Biolgicas CIB de la Universidad Veracruzana para su identificacin botnica y la obtencin de un nmero de Herbario. Las partes areas (Hojas, varas y flores) del material vegetal se secarn a temperatura ambiente y posteriormente se moler para macerar exhaustiva y consecutivamente con disolventes orgnicos de polaridades crecientes: hexano, cloroformo y etanol respectivamente. El disolvente de los extractos se eliminar completamente por medio de rotavapor a presin reducida para obtener los extractos a analizar. Anlisis Fitoqumico El anlisis fitoqumico de los extractos de la planta sern realizados por pruebas colorimtricas y cromatografa en capa delgada de 3 x 5 cm (Domnguez, 1973; Cseke et al., 2006). Determinacin del Potencial Antioxidante in vitro a) Determinacin de la Capacidad Antioxidante mediante la Captura de Radicales Libres con el uso de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). La capacidad de captura de estos radicales libres (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo, DPPH) de cada extracto ser determinada de acuerdo al mtodo de Brand-Williams modificado por Miliauskas (Brand-Williams et al., 1995; Miliauskas et al., 2004). Los radicales del DPPH tienen una absorcin mxima de 517 nm, la cual desaparece mediante un proceso de reduccin con un compuesto antioxidante. La solucin de radicales del DPPH en metanol (9 x 10-5 M) ser preparada antes de usar, 2.9 ml de esta solucin sern mezclados con 100 L de soluciones con metanol grado HPLC (High Performance Liquids Chromatografhy) de los extractos de Salvia purpurea. Las muestras sern incubadas por 30 min a 37 C en un bao de agua, entonces la disminucin en la absorbancia a 517 nm ser medida. Un blanco de la muestra que contenga 100 L de metanol en la solucin de radicales de DPPH ser preparado, su absorbancia ser medida (AB) en cada ensayo. El experimento ser llevado a cabo por triplicado y tambin con tres concentraciones diferentes de los extractos de las plantas para obtener las siguientes: 1000, 500 y 250 g/ml respectivamente. La actividad de captura de radicales libres se calcular usando la siguiente frmula: % inhibicin = [(AB AM)/AB] x 100 En donde: AM= Promedio de las absorbancias de las soluciones 1 y 2 de la muestra AB= Absorbancia del blanco correspondiente a la concentracin de la muestra

AC= Absorbancia del control b) Determinacin del Contenido Total de Polifenoles. Los polifenoles pueden absorber a 765 nm cuando se les adiciona el reactivo de FolinCiocalteu; Funciona midiendo la cantidad de sustancia analizada que se necesita para inhibir la oxidacin del reactivo, por lo que se determina la capacidad reductora. La concentracin fenlica total se determinar usando el reactivo de Folin-Ciocalteu de acuerdo a Spanos and Wrosltad (Spanos and Wrosltad et al. 1990). A 50 L de cada muestra (triplicado), se le adicionan 2.5 mL de una dilucin 1/10 del reactivo de Folin-Ciocalteu y 2 ml de Na2CO3 (7.5 %, w/v) y sern incubados a 45 C durante 15 min. La absorbancia de todas las muestras ser medida a 765 nm usando un espectrofotmetro de UV-VIS. Los resultados se expresarn como miligramos de cido glico equivalentes por gramo del peso seco del extracto (mg GAE/g dw). c) Determinacin de la Capacidad Antioxidante mediante el Poder Reductor de Hierro, FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) En un vial mbar se colocarn 2.7 ml de la solucin FRAP, 150 l del extracto y 150 l de agua destilada. Las absorbancias sern medidas 8 minutos despus de mezclar las soluciones a una longitud de onda de 593 nm. Para la lectura del blanco se emplear solucin FRAP, para la referencia cido ascrbico (33 g/ml) y como control una mezcla con 2.7 ml de solucin FRAP y 0.3 ml de agua destilada. Todas las lecturas se realizarn por duplicado. La capacidad de reduccin frrica se calcular en base a una curva de calibracin. Los resultados se expresarn en mol Fe+2/L. Determinacin de la actividad biolgica in vivo Determinacin de la Actividad Antiinflamatoria Edema inducido en oreja de ratn por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). En el modelo del edema auricular (Young y De Young, 1989), la aplicacin tanto del TPA como de la indometacina ser por va tpica. En el grupo control, se aplicar en una oreja 2.5 g de TPA disueltos en 25 L de acetona (vehculo) y en la otra oreja se aplicar nicamente el vehculo (acetona). La aplicacin de la indometacina y de los extractos se realizar a dosis de 2 mg/oreja disuelto en 50 L de acetona, 30 min despus del TPA. Seis horas despus de la aplicacin del TPA, se sacrificarn a los animales por dislocacin cervical y posteriormente se obtendr el tejido auricular de ambas orejas realizando cortes de 6 mm de dimetro. El porcentaje de inhibicin se

calcular con la diferencia del peso entre ambas orejas con respecto al grupo control. La inflamacin fue comprobada como el incremento en el peso de la oreja en donde se aplica el TPA. % de Inhibicin del edema = [(Wm x100)/Wc] - 100 En donde: Wm = Diferencia del peso entre la oreja con la indometacina o el extracto con respecto a la que tiene TPA Wc = Diferencia del peso entre la oreja con TPA y la oreja con el vehculo. Induccin de edema por carragenina en la pata de ratn (subplantar). En este modelo, la indometacina ser empleada como frmaco de referencia a dosis de 5 mg/kg; mientras en sincrona los extractos se administrarn a dosis de 500 mg/kg por va intraperitoneal (i.p.), 30 minutos antes de la aplicacin subplantar en la pata derecha de carragenina en el ratn; la va ser subcutnea en un volumen de 20 L de carragenina al 1% (Winter et al., 1962). El grupo control slo recibir administracin del vehculo (Tween). El desarrollo del edema se registrar por medio de la medicin del cojinete plantar con la ayuda de un micrmetro digital a diferentes tiempos. El tiempo cero ser considerado a la medicin del cojinete antes de la aplicacin de la carragenina y los tiempos posteriores correspondern a las 1, 3, 5, 7 y 24 hrs despus de la carragenina. El porcentaje de inhibicin se calcular entre las diferencias de las medidas con respecto al tiempo cero. Los resultados sern analizados con respecto al grupo control de acuerdo con (Olajide et al. 1999). Determinacin de la Actividad Analgsica Contorsiones inducidas por cido actico. Se utilizarn ratones en lotes de 8 animales cada uno, un lote ser para el control positivo, otro lote para el control negativo y el otro lotes para el extracto de la planta que halla sido ms activo en los modelos de inflamacin aguda; a los que se les inyectar intraperitonealmente (i.p.) el extracto orgnico e ibuprofeno (control positivo) en dosis de acuerdo a su peso; y solucin salina con tween (control negativo). A los 30 minutos se inyectar (i.p.) cido actico al 0,8 %. En todos los casos el volumen administrado ser de 0,01 mL/g. Posteriormente se colocarn los ratones en cajas separadas y se observarn durante 20 minutos registrndose el nmero de contorsiones del cuerpo y los estiramientos de las extremidades en intervalos de 5 minutos (Collier et al., 1968). Los resultados arrojados se analizarn por grfica de barras por comparativo de los tres lotes.

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Hotplate. En este modelo la estimulacin de dolor, se realizar aplicando calor por contacto mediante una plancha o placa a una temperatura uniforme y constante. Los extractos sern administrados va intraperitoneal, conforme al peso de cada ratn, aparte de un ratn control con ibuprofeno y negativo con solucin salina, 30 minutos antes de colocarlos al estmulo trmico. Se determinar el tiempo de respuesta, con cuatro registros en intervalos de 30 minutos; 0, 30, 90 y 60 min respectivamente que presentan al exponerlos al calor de plancha 50 +/- 2C. Estadstica Los datos obtenidos de los modelos animales sern expresados como error estndar (e.e. ). Los resultados sern analizados por ANDEVA de una va y anlisis de medias de Tukey o Dunet con el programas Signa Stad 0.5. Valores menores de p0.05 fueron considerados significantes. VI. CRONOGRAMA:

En e
Bsqueda Bibliogrfic a Colecta extraccin Eval. Antioxid. Eval AIN Act. Analgesic. Anlisis Estadst. Reporte

Feb

Ma r

Ab r

Ma y

Jun Ju l

Ag o

Sep

Oc t

No v

Di c

Ene Feb

VII. REFERENCIAS

1. Baricevic D, Sosa S, Della-Loggia R., Tubaro A, Simonovska B, Krasna A., Zupancic A.

Topical anti-inflammatory activity of Salvia officinalis L. leaves: he relevance of ursolic acid. Journal of Ethnopharmacoly. 2001;75(2-3):125-32.

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2. Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical method to evaluate

antioxidant capacity. LWT Food Science and Technologic, Volume 28 issue 1 1995. Pp 25-30.

3. Cseke LJ, Kirakosyan A, Kaufman PB, Warber SL, Duke JA, Brielmann HL. 2006.
Natural Products from Plants. Taylor and Franciss CRC Press, Boca Raton, Florida. Pp. 263-318.

4. De Souza, Pereira, Ardenghi, Mora, Bresciani, Yunes, Monache, Cechinel-Filho. Filice

obtained from Adiantum cuneatum interacts with cholinergic, dopaminergic, GABAergic, and tachykinergic systems to exert antinociceptive effect to mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, EL SERVIER. Issue 93, 16 de abril 2009, Brasil. PP 40-46.

5. Domnguez X. A. 1973. Mtodos de Investigacin Fitoqumica. Limusa, Mxico. 6. Hernndez Ortiz Mireya. 1986. Estudio Fitoqumico de Salvia regla Clau. Licenciatura,
Universidad Veracruzana, Qumica Farmacutica Biolgica. Xalapa, Ver. Mxico. Pp 1-2.

7. Jermain John D., M.Sc. and Evans Hiram K., M.Sc. Analyzing Salvia Divinorum and its
Active Ingredient Salvinorin A Utilizing Thin Layer Chromatography and Gas ChromatographyMass Spectrometry. Techinal Note, J. Forensic Sci, May 2009, Vol. 54, No. 3.

8. Lemes Hernndez Ciro Mario, Rodrguez Ferrad Carlos A. y Echevarra Isabel.

Establecimiento de un mtodo de propagacin vegetativa para Salvia Officinalis L. Rev. Cubana Plant Med. Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos Estacin Experimental de Plantas Medicinales "Dr. J.T. Roig" Vol 5. La Habana, Cuba. 2000. P. 103.

9. Meshkatalsadat M.H., Poor Mohammad, Rashidipour F. Chemical Characterization of

volatile organic components of Salvia officinalis using ultrasonic-assited head space solidphase microextraction and hydro-destillation extraction methods. Journal of the University of Chemical Technology and Metallurgy. Volume 44, issue 3, 2009. Pp 291-296.

10. Miliauskas G, Venskutonis PR, Van Beek TA. Screening of radical scavenging activity of
some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chemestry, Volume 85 issue 2, aphril 2004. Pp 231-237.

11. Newall C.A., Anderson L.A., Phillipson J.D. Herbal Medicines. A Guide for Healthcare
Professionals. London: The Pharmaceutical Press, 1996; p. 231-2.

12. Ortega A., Roca A. y Mic J.A. Modelos animales de dolor: Una visin crtica. Revista
Sociedad Espaola del Dolor. Volumen 9, N. 7, Octubre 2002. Pginas 447-453.

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13. Spanos G.A., y Wrosltad, R.E. Influence of processing and storage on the phenolic
composition of Thompson seedless grape juice. Food Chemestry, Volume 38, july 1990. Pp 1565-1571.

14. Winter, C. A.; Risley, E. A.; Nuss, G. W. Carrageenin-induced edema in hind paw of the rat
as an assay for antiiflammatory drugs. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1983, Volume 111. Pp 557.

15. Young JM, De Young LM. 1989. Coetaneous models of inflammation from the evaluation
of topical and systemic pharmacological agents. Pharmacological methods in the control of inflammation. Eds. Chang, J. Y.; Lewis, A. J.; Alan, R. Liss. Inc. New York. Pp 215-231.

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