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Resumen de la unidad VIII. PARTE IV. Mtodos de

propagacin y conservacin de germoplasma
1 Captulo I
1.1 Micro propagacin
1.1.1 Introduccin

La micropropagacin consiste en la propagacin de plantas en un ambiente artificial
controlado, empleando un medio de cultivo adecuado. Esto es posible gracias a la
propiedad de totipotencia que tienen las clulas vegetales. As, las clulas somticas de
cualquier tejido podran formar tallos, races o embriones somticos de acuerdo con la
competencia que posea y al estmulo que reciban.
1.1.2 Etapas de la micropropagacin
La micropropagacin presenta cuatro etapas principales:
1.1.2.1 Etapa0:preparacindelmaterialvegetal
La correcta eleccin y preparacin del explanto incide directamente sobre la calidad del
mismo y su respuesta frente a los dos principales problemas que afectan al establecimiento
del cultivo, que son la contaminacin con microorganismos y la oxidacin del explanto.
Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: el tipo de rgano que sirve como
explanto, la edad ontognica y fisiolgica del mismo, la estacin en la cual se colecta el
material vegetal, el tamao y el estado sanitario general de la planta donante.
La planta donante debe elegirse en base a una seleccin masal positiva para las
caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso
definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro.
1.1.2.2 Etapa1:Establecimientodelcultivo
El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axnicos. En esta etapa los
principales procesos a controlar son la seleccin, el aislamiento y la esterilizacin de los
explantos.
Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de
tejidos meristemticos jvenes, ya sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas.
La obtencin de cultivos axnicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos
preventivos como curativos. Una accin preventiva la constituye el empleo de mtodos de
verificacin de patgenos en los explantos. Tales como: DASELISA o PCR, anlisis generales
para patgenos cultivables para la deteccin e identificacin de patgenos intracelulares
como virus, viroides y bacterias.
1.1.2.3 Etapa2:Multiplicacin
El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos
ciclos de multiplicacin sucesivos.
Los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y cido
giberlico y las condiciones de crecimiento juegan un papel crtico sobre la multiplicacin
clonal de los explantos.
La organognesis puede darse por induccin de yemas axilares o adventicias. La induccin
de yemas axilares comprende la multiplicacin de yemas preformadas.
La embriognesis somtica es una va ms conveniente porque permite saltar las etapas de
formacin de yemas y enraizamiento, regenerando plantas en una forma mucho ms rpida
y eficiente.
Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser
optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicacin determinada.
El principal problema que puede presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro es la
vitrificacin. La cual consiste en un proceso de morfognesis anormal con cambios
anatmicos, morfolgicos y fisiolgicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. Este
fenmeno est regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial
agua, y afecta a dos procesos fisiolgicos fundamentales, la fotosntesis y la transpiracin.
1.1.2.4 Etapa3:Enraizamientoyaclimatizacin
En esta etapa se produce la formacin de races adventicias. En las especies herbceas es
relativamente fcil mientras que en muchas especies leosas resulta ms complicada por
su limitada capacidad rizognica.
El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. Pueden
emplearse varios tipos de substratos y reguladores de crecimiento (principalmente auxinas)
para promover la rizognesis.
Comnmente, a fin de proceder a su enraizamiento, los vstagos de buen tamao
provenientes de la etapa de multiplicacin y provistos de al menos 4-5 yemas, se colocan
durante periodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas.
El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatizacin se logren
simultneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas, asegurando as
una conexin vascular continua entre el vstago y la raz.
1.1.3 Propagacin de especies leosas
El empleo de clones en programas de reforestacin de muchas especies genera al menos
un 10 % de incremento en ganancia gentica en relacin al empleo de plantas regeneradas
por semillas de rboles selectos. Sin embargo, la mxima ganancia gentica puede ser
obtenida mediante el empleo conjunto de propagacin sexual y agmica. La reproduccin
sexual es importante para la introduccin de genes nuevos, prevenir los efectos de la
endogamia y el mejoramiento de caractersticas controladas por efectos aditivos de genes.
La reproduccin asexual por otro lado permite la multiplicacin de individuos o grupos de
individuos seleccionados de una poblacin elite, que exhiben una significativa ganancia
gentica debida a efectos no aditivos de genes.
El principal mtodo utilizado para especies latifoliadas es la brotacin de yemas adventicias,
empleando pices de vstagos, yemas laterales y microestacas. En las conferas, la
elongacin de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy
exitosa
La disponibilidad de protocolos va embriognesis somtica para especies forestales es an
limitada. En la angiospermas los primeros embriones somticos se obtuvieron de Santalum
album, donde sin embargo no fue posible la obtencin de plantas completas. Recin 20
aos despus pudieron lograrse plantas completas de abeto (Picea abies), una
gimnosperma.
Los explantos jvenes de especies leosas, particularmente angiospermas, a menudo
secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados, visibles como pigmentos marrones y/o
negros. Se observa tambin, que en los explantos de rboles adultos el problema se
acenta. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles.
1.1.3.1 Problemasasociadosalamicropropagacindeespeciesleosas
Es mucho ms difcil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son
recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar. Sin embargo, an en estos casos es posible
extraer explantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando
los tejidos ms juveniles dentro de un rbol o, 2) induciendo el rejuvenecimiento del rbol
donante antes de aislar los explantos.
1.1.4 Propagacin de especies herbceas
La micropropagacin de especies herbceas est orientada a proveer material libre de
patgenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor
resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conservar la diversidad especfica en
bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiolgicos y genticos y sentar las
bases para la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica.
Las formas de propagacin son las mismas. Se emplean vas de regeneracin por formacin
de yemas axilares, yemas adventicias y embriognesis somtica. En los dos primeros casos,
el sistema de propagacin a travs de la organognesis directa asegura la estabilidad
gentica de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagacin
clonal a gran escala.
1.2 CAPITULO II.
1.3 SEMILLA SINTETICA
Esta semilla se diferencia de la verdadera en que el embrin es somatico (producido por el
fenmeno conocido como embriognesis somtica) y no cigotico y que si tiene endosperma
y cubierta, estos son artificiales.
El aporte del grupo liderado por Keith Redenbaugh de la PlantGenetic Inc. Fue muy
importante, especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato de
sodio podan ser utilizados para producir semillas artificiales que podan germinar en
condiciones de invernadero.
1.3.1 Tipos de semillas sintticas
Semillas sintticas con embriones desecados sin cubierta:
Es un sistema muy simple, los embriones son desecados hasta alcanzar porcentajes de
humedad de 8- 20%. En este caso los embriones no estn provistos de ningn tipo de
cubierta protectora.
Semillas sintticas con embriones somticos desecados y provistos de cubierta protectora.
Los embriones de zanahoria y apio fueron recubiertos con polyoxietileno y luego desecados.
Los resultados han mostrado que si bien es factible lograr que los mismos sobrevivan, la
conversin en plantas es realmente baja.
1.3.2 Semillas sintticas con embriones hidratados sin cubierta
Es el sistema ms simple, consiste en utilizar los embriones somticos tal como resultan del
proceso de la embriognesis somtica sin ningn tipo de cubierta protectora. Este sistema
ha sido desechado en la prctica por la escasa conversin de embriones en plantas.
Semillas sintticas con embriones somticos hidratados suspendidos en un gel viscoso
(fuiddrilling)
Inicialmente fue desarrollado en zanahoria y ms recientemente con batata
1.3.3 Semillas sintticas con embriones somticos hidratados y provistos de una cubierta
protectora.
Es el sistema ms usado tiene la ventaja de que los embriones no estn sujetos a la
desecacin que constituye la principal causa de bajos valores de conversin en plantas.
una de la tcnicas ms usadas consiste en lograr la formacin de una cubierta protectora
de alginato de calcio que es un compuesto que adems de no ser txico para el embrin
permite una rpida formacin de la cubierta. El proceso es muy simple y consiste
bsicamente en sumergir los embriones somticos en una solucin de alginato de
sodio (2%) y luego sumergirlo en un agente acomplejante [por ejemplo 100 mM de Ca
(NO3)2]. Con esta tcnica se genera una semilla sinttica consistente de un embrin
somtico con una cubierta seminal y un endosperma artificial
1.3.4 Produccin de semillas sintticas

1.3.5 Calidad de la semilla sinttica.
Tengan un alto porcentaje de conversin en plantas cuando las mismas son sembradas
en el suelo. Este aspecto est afectado por varios factores entre los que figuran, el
tipo de embrin, la calidad del endosperma sinttico, la dureza de la cpsula y la
proteccin contra agentes patgenos.
Es altamente deseable que conserven su viabilidad por largo tiempo en condiciones de
laboratorio o mantenidos en refrigeradores comerciales.
1.3.6 Ventajas del empleo de semillas sintticas
El uso de semillas sintticas es ventajosa. Las plantas sern clonadas, es decir cada planta
derivada de una semilla sinttica ser una copia de la planta madre, utilizando
sembradoras similares a las que hoy se emplean con las semillas verdaderas.
Adicionalmente las semillas sintticas podrn actuar como transportadoras de
reguladores de crecimiento, microorganismos y pesticidas que se quieran incorporar
durante la siembra, los costos de los trasplantes se vern reducidos, las poblaciones
sern genticamente uniformes y podrn ser comercializadas ciertos hbridos de plantas
resultantes de costosas manipulaciones manuales.
1.3.7 CAPITULO II
1.4 Conservacin de Germoplasma in vitro.
Mtodos empleados para la conservacin de germoplasma:
sta estrategia a seguir para la conservacin de germoplasma, depende de la naturaleza
del material vegetal, y est definida por la duracin de su ciclo de vida, el modo de
reproduccin y el tamao de sus individuos.
Los mtodos de conservacin de germoplasma se pueden dividir en:
Mtodos de Conservacin in situ;
Mtodos de Conservacin ex situ
Las tcnicas de conservacin de germoplasma mediante el uso de la crioconservacin
ofrecen varias ventajas en relacin con las tcnicas tradicionales de conservacin, pues
permiten la conservacin a largo plazo (aos), presenta bajos costos de mantenimiento,
una fcil manipulacin de las muestras y no dependen del suministro elctrico
1.4.1 LA CRIOCONSERVACION CUENCA CON SIETE PASOS.
1.4.1.1 Seleccindelmaterialacrioconservar:
Cuando se realiza la seleccin del material a crioconservar, se debe tener la absoluta
seguridad de que a partir del mismo se obtienen plantas completas.
1.4.1.2 Deshidratacin
La deshidratacin del explante es un paso crucial para el xito de la crioconservacin, ya
que es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando as
las posibles prdidas por congelacin.
1.4.1.3 Aclimatacin:
La aclimatacin se puede realizar en forma rpida o lenta. La aclimatacin rpida consiste
en colocar el explante directamente en el nitrgeno lquido, con o sin la adicin exgena de
crioprotectores; mientras que la aclimatacin lenta se realiza bajando gradualmente la
temperatura (0.1-3C/min.).
1.4.1.4 Almacenamiento:
-Sistemas Secos: comprende todos aquellos tejidos vegetales endgenamente resistentes y
tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin.
-Sistemas Hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas
temperaturas y a la deshidratacin por lo que se re- quiere una proteccin exgena. Esta
proteccin puede estar dada por el uso de crioprotectores o bien por la utilizacin de
soluciones de vitrificacin.
1.4.1.5 DescongelamientoyRehidratacin:
Cuando se desea recuperar al explante del nitrgeno lquido, se puede realizar un
descongelamiento rpido a Bao Mara (generalmente 1-2 min. a 30 40C) o en forma
lenta sometiendo al explante a temperatura de laboratorio o a una corriente de aire en el
flujo laminar de aire estril.
1.4.1.6 TestdeViabilidad:
Los test de viabilidad nos permiten comprobar las zonas del tejido que han muerto y cuales
han sobrevivido al fro.