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Penicillium Digitatum Sacc
Penicillium Digitatum Sacc
los estudios de Barash y Angel (1970) y Barmore y Brown (1979) sugiriendo que
durante la
invasion de frutos citricos por P. digitatum se producia una disminucion del pH, aunque
en
este caso estaba asociada a la produccion de acido galacturonico. Hasta la fecha la
controversia entre cual de los dos (acido gluconico o acido galacturonico) es el
responsable
de la acidificacion no esta resuelta. Sin embargo, en la interaccion P. expasummanzana,
Hadas y colaboradores (2007) han demostrado que el acido gluconico es un factor
fundamental que contribuye a la enfermedad de la manzana por el hongo. La
acidificacion
del tejido por este acido aumenta la expresion de las enzimas pectinoliticas y el
establecimiento de las condiciones para el desarrollo de este hongo.
Otro factor que tambien ha sido objeto de estudio en la interaccion fruto-patogeno
postcosecha ha sido el rol de los sistemas antioxidantes. En la interaccion planta-hongo
patogeno, se ha demostrado que la generacion masiva de ROS dentro de las celulas
del
huesped contribuye a la defensa del mismo (Lamb y Dixon, 1997). Existen diferentes
actividades enzimaticas, como superoxido dismutasa y catalasa, implicadas en la
regulacion
de las ROS que juegan un importante papel en la resistencia a patogenos (Mittler,
2002).
Torres y colaboradores (2003) realizaron ensayos con dos tipos de frutos de manzana,
los
menos susceptibles a la infeccion por P. expansum mostraron un incremento de los
niveles
de H2O2 junto con una alta actividad superoxido dismutasa (SOD), sin cambios
significativos
en los niveles de catalasa (CAT) o peroxidasa (POX). En los frutos susceptibles, los
niveles de
H2O2 y SOD fueron similares a los de los frutos control. En contraste, la actividad CAT y
POX
se incremento significativamente como consecuencia de la herida y la inoculacion. Por
lo
tanto, estos autores sugirieron que el H2O2 y el metabolismo asociado inducido por la
herida
podrian jugar un importante papel en los mecanismos de resistencia de manzanas a P.
expansum. Macarisin y colaboradores (2007) han demostrado que durante la infeccion
de
frutos de naranja, P. digitatum es capaz de suprimir la acumulacion del H2O2 en las
celulas del
fruto, mientras que un no patogeno, como P. expansum, desencadena una acumulacion
masiva de H2O2 en el exocarpo del fruto. Para colonizar con exito el fruto, P. digitatum
necesita superar los mecanismos de defensa del fruto. Droby y colaboradores (2008)
sugieren que el acido citrico juega un papel en la patogenesis de P. digitatum ya que
inhibe la
produccion de H2O2. Sin embargo, otros acidos como el acido gluconico inducen la
produccion de H2O2. Ballester y colaboradores (2006) han analizado la distribucion
espacial
de las enzimas antioxidantes (superoxido dismutasa, catalasa, ascorbato peroxidasa,
glutation reductasa, peroxidasa) en frutos citricos infectados por P. digitatum,
comprobando
que todas las actividades enzimaticas decrecen a medida que el patogeno progresa a
travs del tejido, pero siguiendo cineticas diferentes, excepto en la catalasa y la
peroxidasa solubles,
que muestran un ligero incremento en el tejido macerado. Torres y colaboradores
(2011)
sugieren tambien que P. digitatum suprime la produccion de H2O2 asi como las
actividades
SOD y CAT producidas en los tejidos de naranja como respuesta al proceso de
infeccion. En
contraposicion, el empleo del agente de biocontrol P. agglomerans CPA-2 activa la
produccion de H2O2 y ambas actividades enzimaticas, probablemente como un
mecanismo
para prevenir al fruto contra futuras infecciones.
En P. digitatum se han caracterizado parcialmente algunas enzimas degradadoras de la
pared
celular vegetal, fundamentalmente pectinasas. El analisis de tres pectinasas, una
poligalacturonasa, una pectin metil-esterasa y una pectin liasa, obtenidas a partir de
sobrenadantes de medios de cultivo de P. digitatum mostro que la unica con capacidad
de
macerar tejido de naranja era la pectin liasa (Bush y Codner, 1968). Sin embargo,
nunca se ha
detectado esta actividad en tejido macerado. Posteriormente se comprobo que la unica
actividad pectinasa detectable en frutos de limon infectados por P. digitatum era
exopoligalacturonasa
(Barash y Angel, 1970). Estos autores propusieron que esta actividad era la
principal, sino la unica, implicada en la maceracion del tejido. Ademas, al tratarse de
una
actividad de tipo exo, podria explicar perfectamente el aumento de acido galacturonico
que
se observa en el tejido macerado. En tejido macerado de naranja infectada por P.
digitatum
la unica actividad detectada fue tambien una exo-poligalacturonasa que hidroliza la
pectina
de la pared celular formando monomeros de acido galacturonico y que demostro ser
capaz
de macerar discos de albedo de naranja (Barmore y Brown, 1979). Con posterioridad a
esta
fecha no hay ninguna referencia bibliografica acerca de las pectinasas de P. digitatum.
Mas
recientemente, se comprobo la presencia de actividad celulasa en frutos de naranja
infectados con P. digitatum, incluso antes de que los sintomas de la infeccion fuesen
evidentes (Barkai-Golan y Karadavid, 1991), pero no se presento ninguna evidencia
que
sugiriera la implicacion de esta actividad en patogenesis.
La inmensa mayoria de los estudios moleculares llevados a cabo en P. digitatum estan
relacionados con la resistencia a fungicidas. Los fungicidas del tipo DMIs constituyen
uno de
los grupos mas importantes de fungicidas, entre los que destaca el imazalil. Desde su
introduccion en 1981, se han descubierto muchas cepas de P. digitatum resistentes
(Eckert et
al. 1994; Wild, 1994; Holmes y Eckert, 1995). El mecanismo de resistencia a DMIs mas
comun
es la aparicion de mutaciones en el gen CYP51, que codifica la citocromo P450 esterol
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alfa-demetilasa. Hamamoto y colaboradores (2000) aislaron este gen de P. digitatum
(PdCYP51) y todas las cepas resistentes que analizaron tenian una repeticion en
tandem de
cinco copias de una secuencia de 126 pb, mientras todas las sensibles solo
presentaban una
copia. Esta secuencia de 126 pb puede actuar como potenciador de la transcripcion
aumentando el nivel de expresion de PdCYP51 y por lo tanto, confiere resistencia a
DMIs.
Mas recientemente, Sun y colaboradores (2011) han caracterizado otros dos nuevos
genes
de P. digitatum de la familia CYP51 (PdCYP51B y PdCYP51C), concluyendo que estos
dos
genes junto con el ya conocido PdCYP51A (previamente PdCYP51) forman la familia de
genes
CYP51 de P. digitatum. El gen PdCYP51B esta involucrado en la resistencia a DMIs por la
presencia de una unica insercion de 199 pb en la region promotora que resulta en la
sobreexpresion del mismo. Con respecto a PdCYP51C no se han detectado cambios
consistentes en la secuencia de nucleotidos o en los niveles de expresion que se
relacionen
con la resistencia a imazalil.
Otro mecanismo para prevenir o reducir la acumulacion de fungicidas DMIs dentro de
las
celulas y por lo tanto, la reduccion o eliminacion de su accion toxica, se basa en la
expulsion
activa de estos compuestos por los transportadores del tipo ABC o MFS. En P. digitatum
han
sido clonados y secuenciados cuatro genes que codifican transportadores ABC [PMR1
(Nakaune et al. 1998), PMR3 (AB164459.1), PMR4 (AB164460.1) y PMR5 (Nakaune et
al.
2002)]. Hamamoto y colaboradores (2001) observaron que la disrupcion de PMR1 en
una
cepa de P. digitatum resistente a DMIs produjo una disminucion en su resistencia y
ademas
el nivel de expresion era ligeramente superior respecto a las cepas sensibles. Otro de
los
genes estudiados es PMR5. Este gen presenta gran homologia con PMR1, y tambien
con atrB
de A. nidulans y BcAtrB de B. cinerea (Schoonbeek et al. 2003); sin embargo, se induce
fuertemente por benzimidazoles, resveratrol y otros compuestos, pero no por DMIs.
Ambos
genes estan involucrados en la resistencia a fungicidas e incrementan su expresion en
presencia de diferentes componentes toxicos (Nakaune et al. 1998, 2002). SanchezTorres y
Tuset (2011) evaluaron la sensibilidad de 75 cepas de P. digitatum a siete fungicidas
diferentes a traves de la caracterizacion molecular de diferentes genes implicados en la
resistencia a fungicidas. Las conclusiones de estos ensayos fueron que muchos genes
estan
involucrados en los mecanismos que confieren resistencia a fungicidas en P. digitatum.
En
algunos casos, la resistencia a un fungicida en particular es determinado por cambios
en un
solo gen, pero en muchos casos, diferentes mecanismos tales como mutaciones que
alteren
la diana de los fungicidas o cambios en la transcripcion, estan involucrados en el
desarrollo
de resistencia a componentes toxicos especificos. En los que respecta al otro tipo de
o mas fungicidas. Las materias activas mas utilizadas son los imidazoles (imazalil (IMZ)
y
procloraz), los benzimidazoles (tiabendazol (TBZ) y benomilo) y ortofenilfenato sodico
(SOPP)
(Eckert y Brown, 1986).
Desde el ano 2000 y mediante una resolucion de la direccion general de Innovacion
Agraria y
Ganaderia (CAPA, 2001) en la que se establecen las normas para la produccion
integrada en
citricos, se establecio que el tiabendazol, el imazalil y el ortofenilfenato sodico son las
tres
unicas materias activas permitidas, especificando que se evitaria en lo posible su
utilizacion.
Esta resolucion se modifico en el 2004 (CAPA, 2004), anadiendo el miclobutanil, el metil
tiofanato y el procloraz a la lista de productos tolerados para los tratamientos
postcosecha
en frutos citricos asi como la homologacion y registro de dichas sustancias por el
Registro
Oficial de Productos Fitosanitarios. Debido al grave problema que representan los
residuos
de productos quimicos para la salud humana, los diferentes Estados, en especial los
mas
desarrollados, han establecido una serie de limites maximos de residuos de fungicidas
postcosecha en frutos citricos (LMR) que para todos los paises pertenecientes a la EU
son los
siguientes: tiabendazol (5 ppm), imazalil (5 ppm), SOPP (12 ppm), miclobutanil (3 ppm)
y
procloraz (10 ppm).
_____________________________Introduccion______________________________
-7La resistencia a los fungicidas puede originarse por varios mecanismos: alteracion del
sitio
diana, reduciendo la union del fungicida; sintesis de una enzima alternativa capaz de
sustituir a la enzima diana; sobreproduccion de la diana del fungicida; descomposicion
metabolica del fungicida o un flujo activo o reduccion de la cantidad admitida de
fungicida
(Fernandes-Ortuno et al. 2008).
En los hongos, los sistemas de transporte han evolucionado para conferir resistencia
natural
contra las sustancias toxicas, por lo tanto, no es sorprendente que estos
transportadores
tambien confieran resistencia a los fungicidas (de Waard et al. 2006; Del Sorbo et al.
2000).
Dos familias de sistemas transportadores de membrana se han relacionado con la
secrecion
de compuestos toxicos: los transportadores ABC (de ATP binding cassette) y los MFS
(Major Facilitator Superfamily). Los transportadores ABC utilizan la energia de la
hidrolisis
del ATP para el transporte de diversas sustancias en contra del gradiente de
concentracion a
traves de la membrana plasmatica. Los transportadores MFS, sin embargo, son
incapaces de
hidrolizar el ATP y usan la fuerza motriz de los protones para facilitar el transporte no
solo de
toxicos sino tambien de azucares, peptidos e iones (Pao, 1998). Estos transportadores
han
sido descritos en varios hongos filamentosos como Aspergillus nidulans, Botrytis
cinerea,
Mycosphaerella graminicola, Magnaporthe grisea, P. digitatum, etc, (Andrade et al.
2000a,
2000b; del Sorbo et al. 2000; Nakaune, 2002; Schoonbeek, et al. 2003; Stergiopoulos
et al.
2002). Por ejemplo, un mutante de B. cinerea en el que se reemplazo el gen Bcmfs1,
que
codifica un transportador MFS, mostro un incremento de la sensibilidad a compuestos
toxicos naturales como la camtotecina y la cercosporina, que son producidos por la
planta
Camptotheca acuminata y por el hongo patogeno de plantas Cercospora kikuchii,
respectivamente. Los transformantes que sobreexpresaron este gen manifestaron una
disminucion de la sensibilidad a estos compuestos y a diferentes fungicidas, incluyendo
azoles. Estos resultados demuestran que el transportador MFS Bcmfs1, esta
involucrado en
la proteccion contra toxinas naturales y fungicidas (Hayashi et al. 2002).
1.3.2 Control alternativo
Debido a toda la problematica expuesta en el punto anterior, todos los recursos y
esfuerzos
que se estan llevando a cabo llevan la misma direccion: conseguir un control integrado
alternativo que permita minimizar las aplicaciones de pesticidas y obtener asi una fruta
libre
de residuos y mas cuando nos referimos al tratamiento postcosecha, ya que es el
proceso
que se encuentra mas cerca del consumidor. El objetivo ideal de cualquier programa de
produccion integrada seria la eliminacion total de fungicidas sinteticos en postcosecha.
Segun la naturaleza, los sistemas alternativos podriamos clasificarlos en fisicos,
quimicos y
biologicos.
_____________________________Introduccion______________________________
efectivos contra P. digitatum y P. italicum son los jasmonatos (Droby et al. 1999) y
algunos
componentes del aroma, como acetaldehido, benzaldehido, etanol, etilformato y 2nonanona (Yuen et al. 1995). Las plantas aromaticas, tales como citrus, producen
aceites
esenciales que basicamente contienen terpenos volatiles tales como el citral, que es un
componente antifungico que representa la primera linea de defensa del flavedo de los
frutos
citricos a la infeccion por P. digitatum (Rodov et al. 1995). La eficacia in vitro del citral
depende del metodo de aplicacion pero la aplicacion in vivo resulto ser fitotoxica y no
prometedora (Klieber et al. 2002). La segunda linea de defensa descrita en frutos
citricos
incluye la sintesis de fitoalexinas, principalmente, cumarinas tales como escoparona,
escopoletina y escopolina. Angioni y colaboradores (1998) aislaron una cumarina, 7_____________________________Introduccion______________________________
propinatos, formatos, cloruros, fosfatos etc. Los mejores resultados para el control in
vivo de
P. digitatum en citricos se obtuvieron con el sorbato potasico y el benzoato sodico
(Palou et
al. 2002). Los tratamientos con carbonato sodico (Na2CO3) y el bicarbonato sodico
(NaHCO3)
son ampliamente utilizados desde hace anos porque son aditivos alimentarios efectivos
y
baratos permitidos sin ninguna restriccion para muchas aplicaciones en la agricultura
organica (Smilanick et al. 1999). El uso de estos aditivos junto con inmersiones
prolongadas
en soluciones calientes permiten un buen control de las podredumbres de citricos
(Palou et
al. 2002).
1.3.2.3 Control biologico
El control biologico se basa en la utilizacion controlada de microorganismos que
antagonizan
con los microorganismos patogenos.
Diversos microorganismos han demostrado su eficacia en el control de P. digitatum y/o
de P.
italicum, como son las levaduras Candida oleophila y Pichia anomala (Lahlali et al.
2004;
Droby et al. 1998), C. saitoana (El Ghaouth et al. 2000), Kloeckera apiculata (Long et
al. 2007)
Debaryomyces hansenii (Singh, 2002), Metschnikowia fruticola y Metschnikowia
pulcherrima
_____________________________Introduccion______________________________
- 11 (Kinay y Yildz, 2008) y Saccharomycopsis schoenii (Pimenta et al. 2008); las bacterias
Pantoea
agglomerans (Teixido et al. 2001;Torres et al. 2007), Bacillus subtilis (Obagwu y
Korsten,
2003), Pseudomonas syringae (Smilanick et al. 1996) y Pseudomonas cepacia (Huang
et al.
1993); y los hongos Aureobasidium pullulans (Wilson y Chalutz, 1989), Trichoderma
viride
(Borras y Aguilar, 1990), Cryptococcus laurentii (Zhang et al. 2004) y Verticillium
lecanii
(Benhamou y Brodeur, 2000).
Dependiendo del tipo de antagonista, el patogeno y el fruto huesped, existen
diferentes
modos de accion que pueden explicar la actividad de biocontrol del microorganismo
antagonista: competicion por nutrientes y espacio, secrecion de antibioticos o la
induccion
de los mecanismos de defensa del huesped (Wilson y Wisniewski, 1994; Droby et al.
1992).
Normalmente, los antagonistas se aplican sobre los frutos citricos en bano o drencher
como
suspensiones acuosas. Algunos se han ensayado como tratamientos precosecha (Droby
et al.
1992) y otros como ingredientes activos en recubrimiento del fruto (McGuire, 1994; ElGhaouth et al. 2001). Un caso atipico son las biofumigaciones de citricos almacenados
con
componentes volatiles producidos por el hongo antagonista Muscodor albus (Mercier y
Smilanick, 2005). Los inconvenientes asociados a la utilizacion de microorganismos
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