Practica 2
Practica 2
Practica 2
UNIDAD DE APRENDIZAJE
Laboratorio de Bioconversiones
PRACTICA 2
INTEGRANTES: EQUIPO 4
PROFESORES
GRUPO
5BV1
FECHA DE ENTREGA
21 de marzo de 2018
Índice
1. Introducción …………………………………….. 3
2. Objetivos …………………………………….. 4
3. Metodología ……………………………………… 4
4. Resultados y discusión………………………… 5
5. Conclusiones ……………………………………. 8
6. Referencias ……………………………………… 9
2
Introducción
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica cuya función biológica es catalizar
reacciones químicas. La función de un catalizador ya sea de naturaleza orgánica
(Enzimas) o inorgánico es disminuir la energía de activación necesarias para alcanzar
el estado de transición de reactivos a productos; por lo tanto, las enzimas no afectan el
equilibrio termodinámico si no que actúan sobre la velocidad acelerando las
reacciones químicas como se observa en la figura 11,3,4. A su vez, los catalizadores
biológicos resultan ser mucho más potentes que los catalizadores inorgánicos, esto se
debe a que los catalizadores orgánicos presentan mucho más afinidad por el sustrato,
son más estables, son específicos para una reacción, su función catalizadora es de
más de un tipo (por ejemplo, algunas enzimas realizan catálisis por posición e
interacción iónica del centro activo con el sustrato), entre otras2.
Figura 1: Energía potencial vs Grado de avance de reacción a) sin catalizador b) con catalizador (Chang,
2003)
. Las enzimas son de vital importancia para que exista la vida, esto debido que la
célula requiere que las reacciones se realicen a una tasa alta para obtener energía
libre suficiente que le permita realizar sus funciones y además para la síntesis de
biomoléculas que le permitan replicarse2. La forma en que las enzimas actúan sobre
los sustratos ha sido descrita de diferentes formas, por ejemplo, el sistema de llave
cerradura; sin embargo, todos coinciden como se muestra en la figura 2 que el
sustrato se une a la enzima formando el complejo enzima sustrato y posteriormente se
transforma liberándose el producto y la enzima libre.
3
Por otro lado, la cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción, los factores
que la alteran y el mecanismo de la misma, la actividad de una enzima se evalúa en
función de la velocidad de la reacción; dicha actividad puede ser inhibida por alguna
molécula (incluso el producto de la reacción, por ejemplo) o por factores ambientales.
Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son: concentración
del sustrato, concentración de la enzima, pH, temperatura, fuerza iónica, etc.
Objetivos
Objetivo General
Objetivos Específicos
Metodología
1. Se preparó un baño maría en ebullición y un baño en hielo
4
2. Se prepararon 36 microtubos de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo DNS, protegiéndolos de la
luz
3. Se preparó un microtubo de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo DNS y 0.1 ml del regulador de
fosfatos en que se preparó la enzima, se utilizó el tubo como blanco del ensayo. Después
se preparó otro microtubo de 1.5 ml con 0.1 ml de reactivo de DNS y 0.1 ml de la solución
de sacarosa, siendo el tubo testigo de ensayo enzimático.
4. En 9 tubos Eppendorf se agregaron 0.95 ml de la solución de sacarosa al 3%, 3 tubos para
cada concentración de enzima.
5. A 3 tubos se le añadió por intervalos de 30 segundos 0.05 ml de solución de invertasa
6. Al pasar 1 y 3 minutos se agregó 0.1 ml de la solución de reacción y se transfirió a otro
tubo con 0.1 ml de DNS por duplicado
7. Se hicieron los puntos 5 y 6 con las demás concentraciones de enzima.
8. Al terminar la cinética enzimática se trataron los microtubos junto con el blanco y el
testigo con la técnica de determinación de azucares reductores.
9. En cada una de las solcuiones enzimáticas proporcionadas por el profesor se determinó la
concentración de proteína por metodo Bardford y UV
10. Utilizando la ecuación de la curva patrón de glucosa se interpolo las absorbancias para
calcular las concentraciones de azucares reductores y las actividades enzimáticas Commented [P1]: Esta no es la forma correcta de redactar una
metodología en un trabajo, busca la practica 1 y checa como
RESULTADOS redacte la metodología y cambiala en ese forma
Absorbancia Concentración
Concentración Absobancia a 590 nm Concentración
a 280 nm real Bradford
Aparente real UV (mg/mL)
1 1 2 3 (mg/mL)
0.1 0.038 0.183 0.181 0.176 0.126 error
5
0.3 0.115 0.549 0.542 0.528 0.236 0.054
0.5 0.192 0.915 0.903 0.880 0.345 0.110
Absorbancia a 540 nm
Concentración tiempo de
Desviación
real de la enzima reacción 1 2 3 4 5 6 Promedio
estándar
(mg/mL) (min)
𝐶𝑓 − 𝐶𝑖
𝐴𝐸 = … … … … … … . [3]
𝑡𝑓 − 𝑡𝑖
Por último dado que se conocida la cantidad de enzima que se adicionó se determinó
la actividad enzimática específica a partir de la cantidad de enzima real calculada
mediante la ecuación 4.
6
𝐴𝐸
𝐴𝐸𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = … … … … . [4]
[𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎]
Tabla 4: AE Y AE específica
Actividad
Concentración Sacarosa Actividad
Intervalo de Promedio de las Concentración enzimática
real de la enzima Dilución consumida enzimática
reacción (min) absorbancias de AR (g/L) especifica
(mg/mL) (g/L) (g/L min)
(g/L min mg)
0-1 1.048 1 8.575 8.146 8.146 0.472
0.345
1-3 1.198 0.5 19.486 18.512 5.183 0.300
0-1 0.5895 1 5.004 4.754 4.754 0.699
0.136
1-3 0.834 0.5 13.816 13.125 4.186 0.616
0-1 0.1755 1 1.780 1.691 1.691 0.268
0.126
1-3 0.657 1 5.528 5.252 1.781 0.283
AR= Azúcares reductores
𝐴𝐸𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 1 𝑚𝑖𝑛
𝐾𝑎𝑡𝑎𝑙 = ∗ … … … . . [6]
𝑃𝑀𝑆𝑈𝑆𝑇𝑅𝐴𝑇𝑂 60 𝑠
Concentración
Intervalo de UI Katal x105
real de la Kcat (1/s)
reacción (min) (μmol/L min mg) (mol/ L s mg)
enzima
0-1 1380.800 2.3 6213.60
0.345
1-3 878.520 1.5 3953.34
0-1 2044.074 3.4 9198.33
0.136
1-3 1799.899 3.0 8099.55
0-1 784.654 1.3 3530.94
0.126
1-3 826.433 1.4 3718.95
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
7
Como se puede observar en la tabla 4 la actividad enzimática depende tanto del
intervalo donde se mida como de la concentración de enzima, la primera es debido a
que como se consume el sustrato, la concentración disminuye hasta llegar al punto
que existan enzimas que no se anclen al sustrato, es decir, se agote el estado de
saturación del sustrato como se muestra en la figura 3, disminuyendo la actividad
enzimática con respecto al tiempo. El segundo, es debido a que cuando existe mayor
cantidad de enzima para la misma concentración de sustrato se transforman un mayor
número de moléculas en un intervalo de tiempo, esto es fácil ver como ayuda del Kcat,
por cada enzima se transforman en promedio 5,700 moléculas de sustrato por
segundo, por consiguiente, al existir un mayor número de enzimas se transformará
una mayor cantidad de sustrato por segundo. Un resultado bastante interesante
también se observa en la tabla 4, con la actividad enzimática en la concentración más
baja en los dos intervalos, como se observa aquí la actividad enzimática parece no
variar mucho, esto se debe a que al existir una cantidad relativamente pequeña de
enzima el estado de saturación se mantiene por mayor tiempo y el consumo del
sustrato con respecto al tiempo varia de forma lineal, este resultado es de suma
importancia ya que si estamos seguros que ocurre esto en un intervalo de tiempo
podemos estimar AE como la pendiente de la recta.
AE
Por otro lado, siguiendo el análisis anterior AE puede estimarse para cada punto como
la pendiente de la recta tangente a la curva del consumo de sustrato con respecto al
tiempo. A su vez, para evitar la dependencia de la concentración de la enzima es
bastante útil convertir la AE a una propiedad intensiva dividiéndola por la cantidad de
enzima usada. Sin embargo, esto no quita la dependencia de la actividad en relación
al agotamiento del sustrato en el tiempo y el perfil de la figura 3 se sigue manteniendo
como se puede comprobar en la tabla 5.
Conclusiones
La cinética enzimática nos ayuda a entender el comportamiento de las
transformaciones biológicas.
La concentración de sustrato en el tiempo influye en la actividad de la enzima
8
La concentración de la enzima influye en el valor de la actividad enzimática
pero no de las otras formas de medición al tratarse de propiedades extensivas
La mayor actividad enzimática se observó con la concentración más alta de
enzima en el intervalo de 0 a 1 minuto, su valor fue de 8.14 g sacarosa/L*min
La actividad enzimática promedio fue de 0.44 g sacarosa/ L min mg enzima
La UI se encuentra en promedio de 1285 μmol/L min mg
El katal es aproximado de 2x10-5 mol/ L s mg
El kcat promedio es de 5,700 s-1.
Referencias
1. Chang (2003), Fisicoquímica para sistemas biológicos, Editorial Mc Graw Hill.
México DF, pp 14-21
2. García González (1998) Bioquímica para ciencias de la salud, Editorial continental,
México DF, pp 254-272.
3. Lehninger. Principios de bioquímica (2006) David L. Nelson; Michael M. Cox. 4ª
Edición. Ediciones Omega.
4. Principios de Bioquímica (2001) Albert L. Lehninger, David L. Nelson; Michael M.
Cox. (2ª y 3ª edición). Ediciones Omega.
Christensen, H.N. y Palmer, G.A. (1980) Cinética enzimática. Ed. Reverté. Barcelona.