Microscopio 2017 PDF
Microscopio 2017 PDF
El objetivo principal de esta primera clase es conocer las características generales, usos y
cuidados del microscopio de manera de lograr adquirir las destrezas necesarias para su
buen uso.
BIENVENIDOS.
“Pensar y obrar, obrar y pensar es la suma de toda sabiduría.”
-J. W. Goethe
EL MICROSCOPIO.
“En su afán de llegar siempre más lejos en la investigación de la naturaleza de lo que los
límites de los órganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido múltiples
instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no podían penetrar. Así
como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el
microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula,
base de la vida.” (Enciclopedia Hispánica)
“Los microscopios son aparatos, que en virtud de las leyes de formación de imágenes
ópticas, aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de
pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibiría”. (Enciclopedia
Hispánica. Tomo 10 pág. 127-128)
El término microscopio deriva etimológicamente del griego mikrós (pequeño) y skoopéo
(observar). En la actualidad existen diferentes tipos de microscopios, herramientas de
trabajo no sólo en el campo del médico y el biólogo, sino de numerosas áreas como la del
criminalista, geólogo, en la metalurgia entre otros.
Consta de una PARTE MECÁNICA que brinda un soporte adecuado a los diferentes
elementos ópticos y a la preparación que se examina, y una PARTE ÓPTICA encargada
de la iluminación y el aumento
PARTE MECÁNICA:
PIE: constituye el soporte del instrumento, debe ser sólido y pesado para asegurar su
estabilidad.
LA COLUMNA: consiste en un vástago vertical que parte del pie. Sus funciones son
relacionarse con el tubo, la platina y portar los mecanismos para el enfoque (Tornillo
macrométrico y micrométrico).
TUBO: es un cilindro metálico, que se ubica en el extremo superior de la columna, cuyo
interior se encuentra pintado de negro para evitar la reflexión de la luz. Su función es
servir de sustentación al ocular y a los objetivos del microscopio, en sus extremos
superior e inferior respectivamente. En su parte inferior existe una pieza llamada
revolver en la cual se enroscan los diferentes objetivos.
REVOLVER: consiste en una pieza circular, que se encuentra en el extremo inferior del
tubo, la cual posee por una de sus caras 3 a 4 orificios donde se enroscan los diferentes
objetivos. Está dotado de un sistema que le permite girar sobre su propio eje y así poder
seleccionar el objetivo con el cual queremos observar.
MECANISMOS PARA EL ENFOQUE: son tornillos que permiten el desplazamiento con
precisión de la muestra o del tubo, para lograr el enfoque correcto de la preparación.
“Manejan el enfoque bien sea por el movimiento vertical de la platina o del tubo, según el
tipo de microscopio.” Se encuentran ubicados en las caras laterales de la columna.
Existen dos tipos de tornillos:
Macrométrico: destinado a realizar movimientos rápidos, para buscar un punto
aproximado al enfoque.
Micrométrico: realiza movimientos lentos, para obtener un enfoque exacto.
Cuando se utilizan objetivos de pequeño aumento es posible enfocar bien una preparación
utilizando sólo el tornillo macrométrico; pero cuando se emplean objetivos de gran
aumento (40X, 100X), el uso del tornillo micrométrico es indispensable.
PLATINA: es una pieza plana,
generalmente cuadrada, con un orificio
central que permite el paso de la luz. Por uno
de sus bordes está conectada con la columna;
sobre ella descansa la preparación a
examinar. Está provisto de dos tornillos que
permiten movimientos laterales y verticales
de la preparación.
Numero de aumento: nos indica la amplificación que tiene la imagen formada por el
objetivo. Generalmente son de 4X, 10x, 40X y 100X.
Abertura numérica: es una cifra que alude a la capacidad de la lente frontal del
objetivo (primera lente) para captar una determinada cantidad de rayos luminosos. De
ella depende la resolución de la imagen. A mayor cantidad de rayos difractados y
captados por el objetivo, mayor será la cantidad de rayos que contribuyen a formar una
imagen precisa. “Para formar la imagen es indispensable la captación de rayos difractados
por la lente frontal del objetivo”. Se encuentra grabada en la manga del lente, siendo de
0,30 para el objetivo de 10X, de 0,65 para el de 40X y de 1,30 para el de 100X.
LR= k x lambda/AN.
donde K es una constante cuyo valor es 0,61; lambda es la longitud de onda de la luz
empleada (para el caso de la luz blanca es de 500nm (0,55) que representa un promedio
de todas las longitudes de onda que integran la luz blanca) y AN es la abertura numérica
del objetivo empleado.
Un sistema tiene un mayor poder de resolución cuanto menor sea la cifra del límite de
resolución.
Esto guarda una relación inversa con la abertura numérica: a mayor abertura
numérica mejor será la resolución. Por otra parte la resolución depende de varios
factores, entre ellos, longitud de onda de la luz, espesor de la muestra, calidad de la
fijación e intensidad de la coloración.
El límite de resolución de los mejores microscopios de luz es de 0,25 m.
Tenemos objetivos secos, que son aquellos que no ameritan de medio de inmersión.
Objetivos húmedos, aquellos que necesitan de un medio de inmersión para lograr el
enfoque
El aumento total del microscopio es igual al producto del aumento dado por el ocular y el
objetivo que se estén usando. Del objetivo depende la resolución y el ocular aumenta la
imagen dada por el objetivo.
Algunas recomendaciones
Gradúe la altura de su asiento de tal manera que pueda sentarse cómodamente frente
al microscopio.
Al inicio de la observación comience siempre por el objetivo de menor aumento.
El condensador debe estar alto y el diafragma abierto.
Coloque el preparado sobre la platina con el cubre objetos hacia arriba.
Enfoque con el macrométrico. Si es necesario utilice luego el micrométrico.
Acostúmbrese a observar con los dos ojos.
Si desea observar una porción en particular del preparado con mayor aumento,
coloque en el centro del campo microscópico lo que se desea observar a mayor
aumento. Luego proceda a cambiar el objetivo y enfocar.
d) MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.
La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir
George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por
Alexander Jablonski. Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados
fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación
intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por
ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de longitud de
onda mayor (de un determinado color, verde, rojo, amarillo).
Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de
inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de
sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la
información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa
desapercibida.
Existen moléculas con fluorescencia natural como la vitamina A y algunos
neurotransmisores.
En general para el estudio con este método la muestra se tiñe con una sustancia
fluorescente que absorbe la energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de
longitudes de ondas más largas (verde).
El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la
técnica de inmunofluorescencia, en la cual una sustancia fluorescente se une a un
anticuerpo específico de la muestra que queremos estudiar. Si el anticuerpo se une al
microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.
La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aun cuando
sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite.
Aplicaciones del microscopio de fluorescencia
Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en
biología y medicina
• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.
• Estudio de células normales y patológicas.
• Estudios inmunológicos.
• Mineralogía.
Sabías que: con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el resplandor de la
luz ambiental.
f) MICROSCOPIO CONFOCAL
La microscopía confocal es una técnica relativamente nueva que está logrando excelentes
resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología, materiales, geología, etc.).
Este sistema óptico combina componentes de un microscopio óptico de campo claro con
un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra. Permite la visualización de
una muestra biológica en tres dimensiones.
Aunque el principio de la microscopía confocal fue dado a conocer por Minsk en 1957 y los
primeros microscopios basados en esta técnica demostraron su validez en 1968, gracias a
los trabajos de Petran y colaboradores; su gran aceptación tuvo lugar hasta hace unos
pocos años con el desarrollo de los láseres y equipos de cómputo.
Su éxito se debe a las ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica convencional
(imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, etc.) y
sobre todo, a la posibilidad de obtener imágenes que permiten su estudio tridimensional.
El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente
procedente de los planos fuera de foco.
“La diferencia principal entre un microscopio convencional y uno confocal es la adición de
una apertura de detector (orificio puntiforme) que está en conjunción con el punto focal
de la lente: por lo tanto es confocal” (Ross 5a edición).
La microscopía confocal permite estudiar muestras que por su grosor o por sus
características, no son transparentes. Con ello se han logrado desarrollar nuevas técnicas
de preparación de muestras, sin implicar el corte en rebanadas delgadas como se hacía
anteriormente, logrando incrementar las posibilidades de estudiar las relaciones
estructura-función, ya sea a nivel uni o multicelular.
Con este sistema se exploran muchos puntos individuales en el mismo plano focal y un
programa informático reconstruye la imagen a partir de los datos registrados durante la
exploración. En este aspecto se parece a la tomografía computarizada.
La resolución de este sistema es de 0.2 a 0.5 m
MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS:
La fuente es un haz de electrones y puede ser
a. Transmisión
b. Barrido
Debido a que la longitud de onda de un haz de electrones es 2000 veces menor que la de
un haz de luz, la resolución aumenta por un factor de 103. El límite de resolución que
pudiese alcanzar es de 0.005nm pero en la práctica es de 0.2 nm, 1.000 veces mayor
que la resolución del microscopio óptico de campo claro.
El principio del microscopio es el siguiente:
La fuente de luz es un filamento de Tungsteno calentado que emite electrones (cátodo).
Los electrones son atraídos hacia el ánodo.
Una diferencia eléctrica entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de aceleración de
entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones con lo que se genera un haz.
Este haz de electrones atraviesa luego una serie de lentes electromagnéticas que
cumplen la misma función que las lentes de cristal del microscopio óptico.
Lente condensadora: forma el haz de electrones que incide sobre la muestra.
Luego una vez que atraviesa la muestra el haz de electrones es enfocado y aumentado
por el lente objetivo.
Finalmente es nuevamente aumentado por la lente proyectora.
La imagen se observa en una pantalla.
El material para ME es procesado con las mismas etapas de la técnica histológica para la
microscopía de luz, pero debido al mayor poder de resolución del ME es necesario utilizar
fijadores que preserven bien los enlaces de proteínas. Como ejemplos de fijadores para la
ME están el Glutaraldehido, paraformaldehido, tetroxido de osmio y permanganato de
potasio. Estos fijadores además actúan como colorantes electrondenso.