MATERIAL DE APOYO-espectroscopia UV-VIS y Colorimetría

ANALISIS QUIMICO INSTRUMENTAL: Espectroscopia UV-VIS y
Colorimetría.
Semana 6 y 7
Espectroscopia UV-VIS y Colorimetría.
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar

la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de
medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la
longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz
absorbida por la misma.
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas

para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro
UVvisible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede
absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura
atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica,
constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento
para la determinación y caracterización de biomoléculas. Las moléculas pueden
absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto
permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y
bacterias.
Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se

origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un
estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía
que permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de
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estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como

consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una
molécula -esto es, su espectro de absorción constituye una seña de identidad de
la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida
hasta el estado energético fundamental.
En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación

electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV
cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm.

Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como
quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples
enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros
heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es
muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos
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orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que

alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros
UV. La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio. En la región
visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe
es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones
de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la
solución coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de
tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
Transmitancia y Absorbancia Cuando un rayo de luz de una determinada

longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una
disolución de un compuesto químico que absorbe luz o cromóforo, el compuesto
absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de
forma que se cumple: Io = Ia + It La transmitancia (T) de una sustancia en
solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector
una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre
ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100 La
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transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y

transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no
es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa. La absorbancia (A) es un
concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de
luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y
transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la
muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log
1 = 0.
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a

través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste.
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de

longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución: A = log I/Io =
ε·c·l La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su
concentración –a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con
ellas-; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual
concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más
moléculas se encontrará-; y por último, depende de ε, una constante de
proporcionalidad -denominada coeficiente de extinción- que es específica de
cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de
las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la
primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones
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de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de

unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso
molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras
unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser
distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina
coeficiente de extinción específico (εs).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c

altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz,
agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y

ultravioleta: espectrofotómetro UV-visible
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos

aparatos llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en
especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los
espectrofotómetros constan de:
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada

longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos)

que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente.
Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio
no transmite la radiación UV.
Colorimetría.
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4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en

señales eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz

y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotómetros
de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de
doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajará con
los de un solo haz. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido
como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del
mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It),
y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la
cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta.
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Obtención de un espectro de absorción
El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de

luz absorbida (ε) a diferentes valores de λ. A partir de una solución diluida de un
compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de medida del
espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de
onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra
a caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que
el compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la
hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El
espectro de absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la
estructura química de la molécula.
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No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los
valores de λmax y εM, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o
moléculas vecinas y la orientación de los cromóforos vecinos; y cada uno afecta
de forma particular. Por ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH son
debidas al efecto de éste sobre la ionización del compuesto. A continuación se
muestran como ejemplo los espectros de absorción de HNTS (un reactivo
empleado para la determinación de especies oxidantes) y comprobándose que
por espectrotometría se puede seguir el efecto que ejercen el pH y los oxidantes.

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La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas

Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se

estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como

En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm.

orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que

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transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y

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de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de

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2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada

3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos)

4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en

5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

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