(Orchidaceae) Ulloa, C. A. - Micropropagacion de Cattleya Skinneri y Cattleya Skinneri X Cattleya Maxima Por Cultivo de Ápices
(Orchidaceae) Ulloa, C. A. - Micropropagacion de Cattleya Skinneri y Cattleya Skinneri X Cattleya Maxima Por Cultivo de Ápices
ESCUELA DE BIOLOGÍA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
Cartago, 2000
INFORME DE PRÁCTICA DE ESPECIALIDAD
Cartago
2000
MICROPROPAGACIÓN DE Cattleya skinneri y
Cattleya skinneri x Cattleya maxima POR CULTIVO DE ÁPICES
i
AGRADECIMIENTOS
Muy especialmente a Marjorie, Grace y Thaís por ser mi grupo de estudio y además,
por brindarme su amistad y confianza durante todos estos años de estudio
A Douglas, Andrea, Kelly, Jose y demás amigos por formar parte importante de mi
vida
ii
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA.............................................................................................................. i
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................... i
ÍNDICE GENERAL...................................................................................................... iii
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. vi
RESUMEN ................................................................................................................. vii
ABSTRACT ................................................................................................................viii
1. INTRODUCCIÓN .....................................................................................................9
2. REVISIÓN DE LITERATURA.................................................................................11
2.1 Generalidades de las orquídeas ..........................................................................11
2.1.1 Perspectiva histórica de las orquídeas..............................................................11
2.1.2 Diversidad y Distribución...................................................................................12
2.1.3 Ecología ............................................................................................................14
2.2 Descripción botánica y anatómica de la Familia Orchidaceae .............................16
2.2.1 Tipo de crecimiento...........................................................................................16
2.2.2 Estructuras vegetativas .....................................................................................16
2.2.3 La flor de las orquídeas.....................................................................................18
2.2.4 Frutos y semillas ...............................................................................................20
2.3 El género Cattleya................................................................................................20
2.3.1 Generalidades y ubicación del género ..............................................................20
2.3.2 Ecología y descripción ......................................................................................21
2.3.3 Cattleya skinneri................................................................................................22
2.3.4 Cattleya maxima ...............................................................................................24
2.3.5 Cattleya skinneri x Cattleya maxima .................................................................25
2.4 Micropropagación.................................................................................................27
2.4.1 Micropropagación de orquídeas........................................................................30
2.4.2 Cultivo de ápices y meristemos en orquídeas...................................................31
2.4.3 Micropropagación de Cattleya por cultivo de ápices y meristemos...................33
2.5 Jardín Botánico Lankester....................................................................................38
3. OBJETIVOS ...........................................................................................................40
4. METODOLOGÍA ....................................................................................................41
4.1 Selección de explantes y desinfección.................................................................41
4.2 Etapa de introducción ..........................................................................................44
4.3 Etapa de multiplicación ........................................................................................46
4.4 Etapa de enraizamiento .......................................................................................48
5. RESULTADOS.......................................................................................................49
5.1 Selección de explantes y desinfección.................................................................49
5.2 Etapa de introducción ..........................................................................................53
5.3 Etapa de multiplicación ........................................................................................56
5.4 Etapa de enraizamiento .......................................................................................58
6. DISCUSIÓN ...........................................................................................................60
6.1 Selección de explantes y desinfección.................................................................60
6.2 Oxidación de los explantes ..................................................................................65
CONTINUA
iii
6.3 Etapa de introducción ..........................................................................................67
6.4 Etapa de multiplicación ........................................................................................72
6.5 Etapa de enraizamiento .......................................................................................76
7. CONCLUSIONES ..................................................................................................79
8 RECOMENDACIONES ...........................................................................................82
9. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................84
ANEXO 1 ...................................................................................................................88
ANEXO 2 ...................................................................................................................89
iv
ÍNDICE DE TABLAS
v
ÍNDICE DE FIGURAS
vi
RESUMEN
vii
ABSTRACT
Shoot apex explants with 3 to 4 leaf primordia from young vegetative shoots of
Cattleya skinneri and Cattleya skinneri x Cattleya maxima plants were inoculated in
aseptic culture. Previously, 4 disinfecting treatments were tested on the explants; the
most effective treatment consisted in a NaOCl double disinfection (3% and 1%, for 10
and 20 minutes, respectively) with a previous immersion in 95% ethanol for 5
minutes. The NaOCl solutions contained 0,5% Physan 20 . Before the inoculation in
aseptic culture the apexes were immersed in Citric Acid solution (100 mg/l) without
effective results, producing high mortality rates. Liquid culture media was the most
effective in starting and multiplication stages, solid culture media was optimum in
rooting stage. C. skinneri responded better on MS (1962) medium supplemented with
0,1 mg/l ANA, 0,2 mg/l KIN and 15% (v/v) Coconut water for the protocorm-like
bodies formation; C. skinneri x C. maxima has a better response in modified Knudson
C (1946) medium for the formation of these structures. Adventitious shoots separation
was the most effective propagation method in multiplication medium supplemented
with 0,18 mg/l ANA, 0,22 mg/l KIN and 15% (v/v) Coconut water. C. skinneri had the
highest shooting rate compared with the hybrid, but both responded better in modified
Knudson C (1946) medium. The rooting stage was performed only with C. skinneri
plantlets cultured on 50% concentration salts and free-hormone Knudson (1946)
medium. Although the rooting process was successful on liquid and solid media, the
last one inducted the highest plant growth and root quantity.
viii
1. INTRODUCCIÓN
La familia de las orquídeas es el grupo más diverso y extenso de plantas con flor
que existe sobre el planeta. La diversidad en tamaño, forma y colores, especialmente
de sus flores, las convierte en un atractivo como plantas ornamentales, aunque
también se han utilizado como comestibles, aromatizantes y medicinales.
Costa Rica es reconocida por poseer una gran diversidad de orquídeas, sin
embargo, muchas de las especies que existen en su territorio (al igual que sucede en
otras partes del mundo) están en peligro de extinción. La deforestación ha provocado
serios daños especialmente en las poblaciones de orquídeas epífitas, las cuales, al
ser tan especializadas en su ecología, se ven seriamente afectadas por los cambios
ambientales. Además de lo anterior, las orquídeas, aunque producen millones de
semillas, poseen bajos porcentajes de germinación en condiciones naturales, ya que
el endospermo que rodea el embrión es muy poco o no existe; para ello, las
orquídeas han desarrollado relaciones simbióticas con hongos que digieren la
materia orgánica y transfieren los carbohidratos al embrión.
9
Cattleya skinneri, conocida comúnmente como Guaria Morada, es la Flor
Nacional de Costa Rica, y es una de las especies en mayor peligro de extinción
actualmente. La urbanización, la extracción de individuos silvestres de los bosques y
el mal manejo que se le ha dado por parte de aquellos que poseen ejemplares, ha
producido esta realidad.
10
2. REVISIÓN DE LITERATURA
Por más de 3000 años las orquídeas han sido apreciadas en el Lejano Oriente, y
su popularización como objeto de cultivo tiene ya mucho tiempo: en la fecha
temprana de 1233 d. C., Chao Shih-Keng publicó si Ching-Chang Lan-Pu, libro
dedicado enteramente a esas plantas (Walter, 1979).
11
En Occidente, cuando las primeras plantas tropicales fueron importadas a
Europa, en el siglo XVIII, cientos de miles de plantas perecieron en el tránsito de los
trópicos americanos a Europa y muchos miles más fenecieron en los invernaderos
ingleses y los del continente, por ignorancia de sus dueños. Los jardineros existosos
guardaron celosamente sus procedimientos de cómo hacer prosperar aquellas
extrañas plantas y llevarlas hasta la floración. Las dificultades de aquellos primeros
intentos de cultivo se debieron, principalmente, a la idea errónea de que las
orquídeas sólo crecían en la oscuridad húmeda y opresivamente cálida de las junglas
tropicales, con lo cual las orquídeas obtuvieron la reputación de ser “frágiles
parásitas”, poseedoras de casi mágicas propiedades y ser en extremo delicadas
(Walter, 1979).
Son plantas herbáceas, perennes, cuyo tamaño oscila entre los 3 a 4 mm hasta
varios metros de longitud. Se encuentran en los cinco continentes y únicamente las
regiones polares y los grandes desiertos no presentan condiciones para su
sobrevivencia. Crecen en las ciénagas, en los desiertos de poca extensión, en las
selvas y en las sabanas. Sin embargo, el mayor número de orquídeas se encuentra
en las zonas tropicales, mencionándose la existencia de unas 20 000 especies
distribuidas en 600 a 900 géneros (González, 1995). Unas especies viven formando
parte de la vegetación emergente de los cuerpos de agua aunque ninguna orquídea
es estrictamente acuática (Walter, 1979).
12
Las orquídeas están distribuidas en un ámbito que va desde 72º norte hasta 52º
sur, entre el 80% y el 90% se concentra cerca del Ecuador en la zona tropical o
subtropical. La mayoría de éstas plantas se localizan entre el sureste de Asia hasta
Indonesia y Australia. En segundo lugar está la zona comprendida entre África y
Madagascar y una tercera zona que va desde México hasta Brasil (Kuan y González,
1993).
Las flores de orquídeas son tan variables como las plantas que las producen. La
más pequeña mide 1 mm de diámetro (Platystele jungermannioides, de América
tropical); la más grande alcanza un diámetro de hasta 25,5 cm (Sobralia macrantha,
de Centroamérica) (Walter, 1979)
En lo que se refiere al color, también existe gran diversidad. Todos los colores
excepto el color negro, se encuentran representados entre las flores de orquídea.
Unas pocas orquídeas tienen flores de un solo color. La forma de las flores va desde
la casi completa simetría radial (como el género Thelymitra) hasta la más extensa
simetría bilateral, como en Oncidium kramerianum de América tropical, o bien, hasta
la asimetría de géneros como Mormodes de México al Brasil y Haemaria (Indonesia)
(Walter, 1979).
13
Otro aspecto variable de las orquídeas es el de las fragancias de sus flores. Los
olores, que son complejas mezclas de sustancias químicas, se pueden producir en
diferentes partes de la flor y, en algunos casos, una misma flor puede producir
diferentes aromas en distintas horas del día o la noche. Aparentemente, esto sucede
para atraer un mayor número y espectro de polinizadores (Walter, 1979).
2.1.3 Ecología
14
seudobulbos, lo mismo que las hojas (gruesas, con cutícula y enceradas) son
otra clara adaptación para almacenar agua y reducir desecación (Abdelnour y
Muñoz, 1997).
Por otra parte, las semillas de las orquídeas son tan pequeñas que contienen
poca o ninguna reserva para llevar a cabo la germinación, es decir, no presentan
endospermo, por lo que en condiciones naturales se asocian con hongos que
digieren la materia orgánica y transfieren los carbohidratos al embrión de la orquídea,
permitiendo que se desarrolle la planta. Además, requieren los polinizadores
específicos para que se efectúe la fecundación. La sumatoria de estos factores hace
que el número de semillas que germinan en condiciones naturales sea muy bajo en
comparación con el número de semillas producido (Abdelnour y Muñoz, 1997).
La mayor parte de las plantas de orquídeas son verdes por tener clorofila y
capaces por esa misma razón de producir sus propios alimentos (autótrofas). Sin
embargo, algunas carecen de esos pigmentos y son incapaces del autotrofismo,
dependen de una relación simbiótica con ciertos tipos de hongos (la mayoría del
género Rhizoctonia), para absorber nutrientes derivados de la descomposición de la
materia orgánica. A estas plantas se les llama saprófitas (Walter, 1979).
En sus ecosistemas naturales, las orquídeas viven en un delicado balance con los
otros organismos del ambiente, por lo que pequeños cambios ambientales tiene
efectos adversos sobre ellas y pueden resultar en disminuciones en las poblaciones
o en último caso pueden llevar a su extinción. En la mayoría de los casos el hábitat
de las orquídeas son los bosques, y aquellas que son epífitas viven en estrecha
dependencia con los árboles. La deforestación implica la muerte de las orquídeas
que viven en los árboles: el sol directo las quema, con la muerte del árbol se
desprende la corteza en donde se hallan aferradas las orquídeas y con la lluvia, el
crecimiento de las malezas y otros, se produce su destrucción (Abdelnour y Muñoz,
1997).
15
2.2 Descripción botánica y anatómica de la Familia Orchidaceae
El sistema radical de las orquídeas, tiene notables modificaciones del tipo normal
de raíz. Sin embargo, al igual que en el resto de las plantas es un órgano vital para el
anclaje de la planta y la absorción de nutrientes. En las orquídeas terrestres, las
raíces son estructuras alargadas y ramificadas, cubiertas de pelillos absorbentes.
Están cubiertas por hifas que las penetran y forman dentro de las raíces nódulos. La
combinación raíz/hongo recibe el nombre de micorriza (Kuan y González, 1993).
Poseen un corto o elongado rizoma, un cormo o tubérculo. Las raíces pueden ser
subterráneas o aéreas, fibrosas, carnosas o tuberosas, fasciculadas o adventicias,
distribuidas sobre el rizoma o el tallo (Rodríguez et al, 1986).
Las raíces de las epífitas son aún más especializadas que las orquídeas
terrestres. En ellas, muchos pelillos radicales se han sustituido por una funda de
células muertas, esponjosas, que se llama velamen. Este velamen facilita la
absorción de agua y minerales (Walter, 1979).
16
Las raíces de las epífitas pueden originarse en cualquier punto del tallo; además
pueden crecer en todas direcciones y no sólo hacia abajo. Su tendencia positiva a
hacer contacto les permite servir de soporte. Las raíces de las epífitas pueden ser
fotosintéticas, lo cual explica la coloración verdosa de sus plantas (Walter, 1979).
Las hojas de las orquídeas siempre son simples, sus márgenes son enteros (no
tienen espinas, ni son aserrados), y por lo general son angostas y alargadas (Kuan y
González, 1993). Las hojas pueden ser basales o caulinares, persistentes o
deciduas, varían de una vaina foliácea a una lámina ancha o angosta con o sin
peciolo. Lámina filiforme u orbicular, de membranácea a carnosa o cariácea,
plegada, convoluta, conduplicada o equitante (Rodríguez et al, 1986).
En las epífitas, la regla general es la de tener hojas gruesas, con una cutícula de
cierto espesor y encerada, que les permite resistir no sólo la depredación por
insectos, sino también los fuertes vientos secos de los trópicos y subtrópicos (Kuan y
González, 1993).
17
Muchas orquídeas poseen hojas muy gruesas que sirven para almacenar agua y
por tanto funcionan como tallos. Numerosas especies que habitan lugares muy
calientes e insolados, tiene hojas casi cilíndricas para reducir la relación
superficie/volumen y evitar así el sobrecalentamiento y la deshidratación. Algunas
autótrofas carecen de hojas y las saprófitas normalmente áfilas a veces presentan
pequeñas brácteas no funcionales para la fotosíntesis (Walter, 1979).
Los sépalos son por lo general órganos desprovistos de clorofila que forman la
funda del capullo y que protegen así la flor. Cuando ésta se abre, los sépalos sirven
como órganos de atracción junto con los pétalos. El tamaño, forma, etc. de éstos es
variable según las especie, aunque es normal que, en una misma flor los sépalos
sean casi idénticos entre sí (Kuan y González, 1993).
18
opuesto a la columna, aunque en orquídeas muy evolucionadas, la antera fértil
se recurva hacia abajo hasta quedar frontal al labelo (Walter, 1979).
Las flores de las orquídeas son bisexuales o perfectas. Son notables las
excepciones en que las flores son unisexuales (ejemplo Catasetum y Cynoches)
(Kuan y González, 1993).
La columna es la estructura más característica de las orquídeas y está formada por
la fusión del pistilo y los estambres; en el ápice o sobre la parte dorsal de ésta se
encuentra la antera, protegiendo los polinios, éstos son suaves, céreos o duros,
desnudos o con caudículas, o adheridos a un estípite o viscidio para formar una
estructura compleja: el polinario. El estigma se ubica cerca del ápice de la columna,
es entero a bilobulado. El ovario es ínfero, trilocular o unicular a la madurez
(Rodríguez et al, 1986).
19
En los procesos de polinización, aunque los visitantes acarrean polen, es
paradójico el hecho de que en ningún caso el polen es una recompensa nutritiva. En
su lugar, ésta consiste en néctar, aceites o compuestos aromáticos (Walter, 1979)
20
Las cattleyas son originarias de las alturas medias de América Central y Sur
América. En el mundo se encuentran cerca de 65 especies diferentes (Kuan y
González, 1993)
Las especies de este género se han dividido en dos grupos: las cattleyas labiatas
o unifoliadas (generalmente de Sur América), que tienen una sola hoja que sale del
ápice del seudobulbo, sus flores son grandes y de pétalos anchos y vistosos.
Normalmente producen dos o tres flores, que se mantienen por 1 a 4 semanas,
ocurriendo un máximo de dos floraciones al año. El requerimiento de luz de éstas
cattleyas es mayor que el de la bifoliadas (Kuan y González, 1993). Las especies
más representativas de este tipo son C.mossaie,. C. trianaei, C. dowiana, C.
gaskelliana, C. lawranceana, C. lueddmanniana, C. mendellii, C. percivaliana, C.
schroederae, C. warnerii, C. warscewiczii, C luteola, C. maxima (Horich, 1980).
El otro grupo es el de las bifoliadas, porque tienen dos y algunas veces tres hojas,
muy diferentes al tipo labiata (Horich, 1980). Las cattleyas bifoliadas
(Centroamérica), tiene flores pequeñas (en racimos de veinte o más flores) pero
frecuentemente de más intenso y variado color que las unifoliadas, además de tener
mejor textura. Dentro de este grupo se puede encontrar entre otros a C. bicolor y C.
skinneri. Los híbridos entre estos dos grupos han producido flores donde se
combinan las mejores características de ambas (Kuan y González, 1993).
21
cuales constituyen una defensa contra la sequía periódica. Las hojas pueden
ser lanceoladas o elípticas, obtusas, coriáceas o carnosas, lisas, sésiles y con
venación conduplicada.(Rodríguez et al, 1986).
Para florecer bien, las cattleyas necesitan luz abundante pero no directa entre
2000 y 3000 pies bujía. La luz acelera el proceso de crecimiento de la planta para
que esta luego florezca bien (Horich, 1980).
Cattleya skinneri es una especie del grupo bifoliado, que se encuentra desde
Guatemala a Costa Rica y florece principalmente en febrero, marzo y abril. Tiene el
22
labelo enrollado en forma de corneta, con el borde delantero de color lila muy
intenso, seguido de una garganta blanca con un tinte amarillento y de una mancha
morada en el fondo (Rodríguez, 1995).
Mediante el acuerdo ejecutivo #24 del 15 de junio de 1939, fue declarada la Guaria
Morada (C. skinneri) como Flor Nacional de Costa Rica (González, 1995),
corresponde a la forma normal y más abundante de la especie, con tallo con dos
hojas y racimos de flores lila (“morada”) (Rodríguez, 1995).
23
Figura 2.1 Inflorescencia de Cattleya skinneri. 1996 Greg Allikas
24
Figura 2.2 Flor de Cattleya maxima. 1996 Greg Allikas
Esta planta es un híbrido entre Cattleya skinneri y Catlleya maxima, por lo tanto
se define como un híbrido interespecífico (Warner, 2000). La planta de C maxima x
C. skinneri es epífita, perenne, con un rizoma cubierto por brácteas. Los seudobulbos
alcanzan tamaños de hasta 30 cm de largo, los cuales están cubiertos por brácteas
papiráceas basales. El híbrido es bifoliado y las hojas se sitúan en el ápice del
seudobulbo, son lanceoladas, coriáceas y sésiles (Warner, 2000)
25
los lóbulos laterales envuelven la columna (ligeramente arqueada) y el borde
del labelo presenta márgenes ondulados; el callo presenta remación amarilla. La
antera es terminal, incumbente, operculada con dos celdas, cada una dividida por un
septo. Los polinios son 4, céreos, elíptico-ovados, con caudículas.. El estigma es
entero (Warner, 2000).
Figura 2.3 Planta de Cattleya skinneri x Cattleya maxima mantenida en condiciones de invernadero
en el Jardín Botánico Lankester
26
Figura 2.4 Inflorescencia del híbrido Cattleya skinneri x Cattleya maxima
2.4 Micropropagación
27
a. Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo
b. Reducción del tiempo de multiplicación
c. Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie
reducida, a bajos costos y en un tiempo económicamente costeable.
d. Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga
e. Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro, con menos
restricciones aduaneras
f. Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existan pocos
individuos (Villalobos y Thorpe, 1991).
Murashige (1974; 1977) encontró que era útil destacar la secuencia de eventos
asociados con la multiplicación de plantas mediante las técnicas de cultivo aséptico,
de la siguiente manera:
Etapa I. Iniciación o establecimiento (se establece el cultivo inicial o primario)
Etapa II. multiplicación de brotes o multiplicación de plantas.
28
Etapa III. Corresponde al enraizamiento o etapa de pretransplante; tiene como
objetivo producir una planta autotrófica que pueda sobrevivir en las condiciones del
transplante al suelo (Krikorian, 1991b).
Además de las anteriores, pueden considerarse otras dos etapas como parte
integral del procedimiento:
Etapa IV: Transferencia final a la etapa de medio ambiente
Etapa 0. Etapa inicial, que comprende la selección de la planta madre y la selección
de una modalidad de pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte
(Krikorian, 1991b).
29
d. Medio de cultivo: el éxito en el cultivo de tejidos depende de la selección del
medio de cultivo, incluyendo su composición química y forma física (Villalobos y
Thorpe, 1991). Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo in vitro de un
determinado explante, es necesario elegir un medio apropiado de cultivo, en el
cual hay que considerar no sólo sus componentes sino su preparación; existen
innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 y 35
compuestos químicos que suministran: carbono, nutrimentos minerales,
vitaminas, agente gelificante (en caso de medios semisólidos), sustancias
reguladoras del crecimiento, y otros compuestos (Mroginski y Roca, 1991).
30
forma no germinaría, además de que en condiciones naturales la germinación
de orquídeas es muy baja (alrededor del 5% del total producido en una cápsula). La
germinación de semillas in vitro fortifica los esfuerzos de conservación de orquídeas
al ofrecer una mayor cantidad de plantas a un menor precio, evitándose así el
saqueo de individuos silvestres (kuan y González, 1993)
31
descubrimiento de la capacidad que tienen las puntas de los brotes y los
meristemos de Cymbidium sp., cortados apropiadamente y sembrados en cultivo
aséptico, para producir protuberancias que asemejan protocormos normales capaces
de crecer y desarrollarse en plántulas (Krikorian, 1991b).
32
Los protocormos que se desarrollan después de la germinación de una semilla de
orquídea, tienen un estado morfológico entre un embrión indiferenciado y un vástago.
La formación de cuerpos protocórmicos formados con el cultivo de meristemos,
significa que el ápice del vástago de una planta adulta se rejuvenece. Debido a que
los protocormos obtenidos por germinación de semillas tienen muchas semejanzas
(formación de rizoides, formación espontánea o inducida de protocormos a partir de
fragmentos de protocormo, polaridad débil) con los producidos a partir de ápices de
vástagos, se introdujo el término cuerpo protocórmico, cuando se clonan orquídeas
por cultivo de meristemos (Pierik, 1987)
33
Kuan y González (1993) mencionan una desinfección cuádruple de brotes de
Cattleya en hipoclorito de sodio (NaOCl) comercial: una inicial con una solución al
10% (v/v) por 15-10 minutos, luego se eliminó 2 o 3 hojas del brote y se sumergió en
NaOCl al 5% (v/v) por 8-10 minutos; posteriormente, y luego de eliminar los
primordios de hoja, se colocó en una solución al 3% (v/v) por 3-5 minutos;
seguidamente se eliminaron los primordios de hoja y se sumergió un cubo apical de
2 mm2 en NaOCl al 1% (v/v) colocándolo finalmente en un medio Murashige y Skoog
(1962).
Gutiérrez y Chen- Han (1994) utilizaron tres tipos de híbridos de Cattleya: Lc.
Dismore Perfection, Lc. Puppy love y Lc. Shellie Compton. Los brotes (de 5-8 cm)
fueron sometidos a una desinfección doble con NaOCl. Antes de la primera
desinfección se eliminaron de 1-2 hojas del brote dejando expuestas las yemas
laterales. La desinfección superficial se realizó con NaOCl al 1% más tres gotas de
Tween 20 por 5 minutos en un lavador ultrasónico y 10 minutos fuera de éste.
Después de realizar tres lavados en la cámara de flujo laminar y de extraer 2-3 hojas
más del brote se introdujo en NaOCl al 0,5% más tres gotas de Tween 20 durante 15
minutos. Finalmente se efectuaron tres lavados con agua y un lavado en Ácido
Cítrico (100 mg/l) antes de extraer las yemas laterales y el meristemo e introducirlos
en medio de iniciación líquido (120 rpm), que consistió en un MS (1962) con 1/3 de la
concentración de sales, 10 mg/l de Adenina, 1,75 mg/l de Bencil Adenina (BA), 1,75
mg/l de Ácido Naftalenacético (ANA), 2 mg/l de Glicina, 15% (v/v) de Agua de coco y
20 g/l de sacarosa; en este medio los explantes estuvieron por 16 semanas. Para la
fase de multiplicación cada protocormo se dividió en 3-4 segmentos y se inocularon
en dos tipos de medio de cultivo: uno idéntico al primero pero en estado semisólido y
otros que sustituye las sales MS (1962) por Hyponex #1 (7-6-19) también en estado
semisólido. La etapa final de enraizamiento se realizó en un medio semisólido con
2,5 g/l de Hyponex #1 (7-6-19), Vitaminas B5, 1cc de Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D), 50g/l de banano, 30 g/l de sacarosa y 1,2 g/l de
34
Carbón Activado. El ciclo de propagación clonal in vitro fue calculado en 12
meses (para estos híbridos).
35
iniciación Lindemann et al. (1970) líquido enriquecido con 0,1 mg/l de ANA, 0,2
de KIN y 15% de Agua de coco. Luego de 2 meses, se formaron los cuerpos
protocórmicos, los cuales fueron multiplicados en un medio líquido Lindemann et al.
(1970) conteniendo 0,2 mg/l de ANA, 0,22 mg/l de KIN, 0,35 mg/l de Ácido Giberélico
(GA3), 15% de Agua de coco y 100 mg/l de Caseína Hidrolizada. Las subdivisiones
de los cuerpos protocórmicos se realizaron en intervalos de un mes. El enraizamiento
se realizó en un medio Knudson C (1946) donde las plantas tardaron 10 días en
emitir raíces.
36
Ápices de brotes de 2-5 cm de longitud sin las hojas desplegadas fueron
utilizados por Huang (1984). Después de remover las hojas superficiales, los brotes
fueron lavados y sumergidos en una solución antioxidante de 100 mg/l de Ácido
Ascórbico y 150 mg/l de Ácido Cítrico; posteriormente se introdujeron en una dilución
1:10 de Purex (NaOCl al 5% -5,25%) por 20 minutos al vacío. Luego se realizó un
lavado con agua estéril y los brotes se introdujeron nuevamente en Purex pero en
una dilución 1:10 por 1 minuto para finalmente hacer un baño con una dilución
1:1000. Los explantes fueron noculados en un medio líquido de iniciación MS (1962)
modificado conteniendo 0,1 mg/l de ANA, 1 mg/l de Bencil Adenina (BA), 10 mg/l de
Sulfato de Adenina y 15% de Agua de coco. Para la multiplicación de los cuerpos
protocórmicos se utilizó un medio semisólido MS (1962) modificado con 0,1 mg/l de
ANA, 1 mg/l de BA, 10 mg/l de Sulfato de Adenina y 15% de Agua de coco.
Finalmente, el enraizamiento se llevó a cabo en un medio semisólido MS (1962)
modificado con 0,3 mg/l de ANA y 30 mg/l de Sulfato de Adenina.
37
lugar en medios líquidos, y el crecimiento de estas estructuras hasta plántulas,
nuevamente en medio sólido (Leffring, 1968).
38
particular orquídeas, mediante tres áreas específicas: horticultura, investigación y
educación ambiental (Warner, 2000)
39
3. OBJETIVOS
40
4. METODOLOGÍA
Figura 4.1 Invernadero del Jardín Botánico Lankester de donde se extrajeron las plantas de Cattleya
skinneri y Cattleya skinneri x Cattleya maxima donadoras de explantes.
Los explantes que se utilizaron para ambos tipos de orquídea fueron ápices de
brotes laterales de 4-7 cm de longitud. Los brotes de estas plantas se cortaron desde
su base con un bisturí previamente desinfectado con alcohol (etanol) de 95º. Las
plantas seleccionadas para la investigación debían poseer dos puntos de
41
crecimiento, de los cuales se extrajo el brote de uno de ellos. Los individuos
utilizados no recibieron ningún tratamiento especial antes de extraer los brotes.
Figura 4.2 Brote lateral de Cattleya skinneri x Cattleya maxima utilizado como explante inicial para el
cultivo in vitro de ápices
Una vez cortados los brotes, estos se llevaron al laboratorio, y en todos los casos
fueron sumergidos en agua con detergente en polvo (1,5-2 g de detergente por cada
42
100 ml de agua) más 3 gotas detergente líquido, durante 10 minutos, en constante
agitación.
43
Tabla 4.2 Tratamientos de desinfección realizados en brotes laterales de C. skinneri x C. maxima
Después del último lavado con agua destilada estéril, los brotes (en todas las
desinfecciones) fueron disectados hasta obtener el ápice con 3-4 primordios foliares.
Antes de introducir los explantes en medio de cultivo, los ápices se sumergieron en
una solución de Ácido Cítrico (100 mg/l) durante 1 minuto, excepto en la desinfección
IV (tanto de C. skinneri como de C. skinneri x C. maxima) en que esta inmersión tuvo
una duración de dos minutos.
a. Medio con sales de Murashige & Skoog (1962) (Anexo 1) complementado con
0,031 mg/l de Cloruro de Níquel (NiCl • 6H2O), 2 mg/l de Glicina, 0,5 mg/l de
Piridoxina, 0,1 mg/l de Tiamina, 0,1 mg/l de ANA, 0,2 mg/l de Kin, 15% de Agua
44
de Coco y 15 g/l de sacarosa. Este medio se utilizó en forma semisólida (2 g/l de
Phyta-Gel) y líquida.
Medio de cultivo
Tratamiento de Estado del medio MS (1962) Knudson C (1946)
Desinfección de cultivo modificado modificado
I Semisólido 2 2
Líquido 0 1
II Semisólido 3 1
Líquido 1 0
III Semisólido 1 2
Líquido 2 2
IV Semisólido 3 3
Líquido 3 3
Medio de cultivo
Tratamiento de Estado del medio MS (1962) modificado Knudson C (1946)
Desinfección de cultivo modificado
I Semisólido 1 4
Líquido 1 0
II Semisólido 1 3
Líquido 1 0
III Semisólido 2 2
Líquido 0 1
IV Semisólido 2 3
Líquido 3 4
45
Todos los medios de cultivo se ajustaron a un pH de 5,5, y se colocaron en el
cuarto de crecimiento en condiciones de luz directa (1500-3000 lux) utilizando dos
tipos de fluorescentes (Growth Lux y Day Light). La temperatura se mantuvo en (22 ±
2) oC, y el fotoperíodo en 12 horas luz. Los medios de cultivo líquidos, con un
volumen de 50 ml y contenidos en erlenmeyers de 250 ml, se colocaron en agitación
constante a 95-100 rpm.
a. Medio con sales MS (1962) (Anexo 1) complementado con 0,031 mg/l de NiCl •
6H2O, 2 mg/l de Glicina, 0,5 mg/l de Piridoxina, 0,1 mg/l de Tiamina, 0,18 mg/l de
ANA, 0,22 mg/l de Kin, 0,35 mg/l de AG3, 15% de Agua de Coco y 20 g/l de
sacarosa.
46
Las condiciones físicas, la velocidad de agitación (95-100 rpm) y el pH del medio
de cultivo se mantuvieron iguales que en la etapa de introducción. Después del
segundo subcultivo se redujo el volumen de 50 ml a 20 ml. La frecuencia de
transferencia continuó siendo de tres semanas.
47
4.4 Etapa de enraizamiento
48
5. RESULTADOS
49
Los porcentajes de oxidación fueron variables, pero siempre iguales o mayores al
50% (Tabla 5.2).
50
100 C. skinneri
C. skinneri x C. maxima
80
Porcentaje de 60
contaminación
(%) 40
20
0
I II II III IV
Tratamiento de desinfección
MICROSOFT EXCEL 97
51
C. skinneri
C. skinneri x C. maxima
80
70
60
50
Porcentaje de
oxidación (%) 40
30
20
10
0
Semisólido Líquido
Estado físico del medio de cultivo
MICROSOFT EXCEL 97
52
5.2 Etapa de introducción
C. skinneri
C. skinneri x C. maxima
70
60
50
Explantes con
40
formación de
cuerpos
30
protocórmicos (%)
20
10
0
M&S (1962) modificado Kunson C (1946) modificado
Medio de Cultivo
MICROSOFT EXCEL 97
Figura 5.3 Porcentaje de explantes de C. skinneri y C. skinneri . maxima con formación de cuerpos
protocórmicos de acuerdo con el tipo de medio de cultivo
53
Respecto a la formación de cuerpos protocórmicos de acuerdo al estado físico del
medio de cultivo, un 83,33% formaron cuerpos protocórmicos en medio líquido en
comparación con 33,33% en C. skinneri. En el caso de C. skinneri x C. maxima, la
formación de estas estructuras solamente se dio en medio de cultivo líquido (100%)
(Figura 5.4).
100
90 Medio semisólido
80 Medio líquido
70
60
Porcentaje de
50
explantes (%)
40
30
20
10
0
C. skinneri C. skinneri x C.maxima
Especie
MICROSOFT EXCEL 97
54
protócormicos en medio semisólido MS (1962), fue el que más tardó en hacerlo (6
semanas después de la introducción) (Tabla 5.4).
55
El único explante que formó cuerpos protocórmicos (un total de 2) en medio
semisólido (perteneciente a la especie C. skinneri) se dañó completamente en uno
de los subcultivos de esta etapa de introducción, sin embargo, su estado de
desarrollo era avanzado (aunque no había producido brotes).
56
Se notó que cuando la división de los brotes se hacía en una etapa temprana de
crecimiento (menos de 0,5 cm), el 100% de los brotes separados moría en un lapso
de 4 a 5 días, pues se tornaban de un color café oscuro, semejante al visualizado en
los cuerpos protocórmicos divididos por seccionamiento. Por el contrario los brotes
con una longitud de 1,5 cm o más (Figura 5.7) sobrevivía perfectamente e incluso
generaba más brotes en su base.
Figura 5.7 Brotes adventicios de C. skinneri con desarrollo foliar en etapa de multiplicación
57
C. skinneri
C. skinneri x C. maxima
2
1.8
1.6
Índice de 1.4
brotación 1.2
(número de 1
brotes/semana)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
M & S (1962) modificado Knudson C (1946)
modificado
Medio de cultivo de multiplicación líquido
MICROSOFT EXCEL 97
Figura 5.8 Índice de brotación de C. skinneri y C. skinneri x C. maxima, en dos diferentes medios de
cultivo líquidos de multiplicación
58
Las vitroplantas colocadas en medio líquido Knudson C (1946) modificado
desarrollaron en promedio 2,4 raíces, mientras que las plantas cultivadas en medio
semisólido presentaron 3 raíces en promedio. Se observó daño (tejido color café) en
el tallo y las hojas de las vitroplantas mantenidas en medio líquido, incluso se dio el
desprendimiento de raíces en algunas de ellas. La estructura de las vitroplantas en
medio semisólido fue muy diferente: tallos y hojas verdes e intactas, raíces más
gruesas y con presencia de vellosidades.
59
6. DISCUSIÓN
6.1 Selección de explantes y desinfección
60
Todos los tratamientos de desinfección a que fueron sometidos los brotes fueron
similares: un lavado inicial con detergente para eliminar las partículas e impurezas
más grandes, seguido de una inmersión en alcohol de 95º; posteriormente una
desinfección inicial con NaOCl más fuerte que la segunda (también en NaOCl), y 3
lavados con agua destilada estéril después de cada desinfección con NaOCl para
eliminar los restos de los compuestos químicos. El alcohol de 95º, además de servir
como agente bactericida, se utilizó como surfactante para que los tejidos fueran
fácilmente penetrados por los siguientes germicidas (el NaOCl en este caso). La
primera desinfección con NaOCl se utilizó siempre en mayor concentración que la
segunda, pues el tejido inicial (hojas superficiales del brote lateral entero) requería
una desinfección sin importar el daño de ese tejido, ya que no era el explante de
interés; además, por tratarse de un brote cerrado, el contacto del alcohol y del NaOCl
de la primera desinfección difícilmente alcanzó el meristemo apical. La segunda
desinfección con NaOCl se utilizó siempre en menor concentración respecto de la
primera, pues ya para el momento de su realización, se habían eliminado algunas
hojas superficiales, lo que incrementaba la posibilidad de contacto del compuesto
químico con el meristemo apical, el cual es un tejido muy sensible (Flores, 1998).
61
nunca fue variada, es decir, no constituyó una variable, por lo que no puede
afirmarse que esa fuera la ideal para la especie y el híbrido utilizados. El detergente
líquido en las soluciones de NaOCl se utilizó como agente tensoactivo para reducir la
tensión superficial del agua y permitir así un mejor acceso de los desinfectantes al
tejido vegetal.
62
del 1% (del compuesto activo), la cual fue lo suficientemente fuerte para
desinfectar el explante sin dañarlo; la concentración fue menor por la disección
realizada luego de la primera desinfección.
63
situaciones donde sólo se presentó contaminación por bacteria, el proceso de
desinfección superficial pudo tener éxito, pero la presencia de bacteria endógena
eliminó el explante. A pesar de esta posibilidad, la contaminación por bacteria
endógena se contempló dentro de los porcentajes de contaminación por
desinfección.
El explante extraído de los brotes laterales consistió del ápice con 3-4 primordios
foliares, pues esto incrementaba la posibilidad de una respuesta morfogenética si se
compara con un explante que consista sólo del meristemo apical o que posea 1 o 2
primordios foliares inclusive. Los explantes grandes son más difíciles de esterilizar
que los pequeños, pero generalmente los primeros poseen un potencial regenerador
considerablemente mayor; la viabilidad y la capacidad regenerativa de explantes muy
pequeños tiende a ser baja; los explantes pequeños tienden, además, a ser dañados
más fácilmente (Litz y Jarret, 1991). Además, como el objetivo de la investigación
era la micropropagación y no la limpieza de virus, un explante de mayor tamaño
aumentaba la posibilidad de éxito. Las investigaciones llevadas a cabo por Morel
(1960) con Cymbidium, demostraron que se obtenían plantas libres de virus, sólo en
el caso de que se utilizaran meristemos (de aproximadamente 1mm) con dos
primordios foliares; el clonado que se hace con porciones apicales de vástago mucho
más grandes que las utilizadas por Morel, tiene pocas probabilidades de producir
plantas libres de virus (Pierik, 1987).
64
6.2 Oxidación de los explantes
65
debido a su oxidación (Pierik, 1987). Es por eso que la oxidación se presentó
justo después de realizar los cortes, y los lavados no resultaron ser tan efectivos. El
uso de medio líquido para una mayor difusión de los fenoles y el uso de Carbón
Activado en medio semisólido de enraizamiento fueron las prácticas alternativas para
contrarrestar la oxidación, produciendo una respuesta positiva.
66
6.3 Etapa de introducción
67
El uso del agua de coco es bastante común en el cultivo de meristemos de
Cattleya, especialmente en la etapa de introducción (Lindemann et al., 1970; Morel,
1970; Scully, 1967; Huang, 1984; Gutiérrez y Chen-Han, 1994) por su capacidad de
estimular la formación de cuerpos protocórmicos en las células epidérmicas (Homes
et al., 1972). La composición del agua de coco utilizada no se determinó, y varió en
algunos medios de cultivo pues se utilizaron varios cocos, cuya procedencia y estado
de maduración era desconocida, produciendo probablemente diferencias en la
respuesta de los explantes.
68
La respuesta en cuanto a formación de cuerpos protocórmicos fue mejor en C.
skinneri que en el híbrido, pues el 60% de los explantes de esta especie que
sobrevivieron al proceso de desinfección y a los efectos de la oxidación produjeron
estas estructuras, mientras que sólo el 50% de los explantes del híbrido lo lograron.
Sin embargo, se dio una respuesta diferencial de acuerdo al tipo de medio de cultivo,
pues los explantes pertenecientes a C. skinneri lo hicieron en mayor proporción en
medio MS (1962) modificado que en medio Knudson C (1946) modificado (66,67%
contra un 33,33%); una respuesta contraria se dio con el híbrido C. skinneri x C.
maxima donde el 66,67% de los explantes formó los cuerpos protocórmicos en medio
Knudson C (1946) modificado. El medio de cultivo MS (1962) modificado utilizado en
la fase de inducción fue un medio más rico que el medio Knudson C (1946)
modificado, pues contenía mayor porcentaje de nitrógeno y vitaminas (ausentes en el
medio Knudson); sin embargo, en el caso de C. skinneri x C. maxima la respuesta
podría depender más de la constitución genética que del medio de cultivo, pues la
mayor formación de cuerpos protocórmicos se dio en el medio menos rico. El hecho
de haber utilizado agua de coco sin la información del lugar de procedencia, estado
de maduración y constitución química también pudo tener repercusiones
diferenciales en la respuesta in vitro del material utilizado, especialmente por la
presencia de reguladores de crecimiento que pudo variar significativamente.
69
El fenómeno de formación de cuerpos protocórmicos es una característica
genética propia de las orquídeas y su estructura supone un uso distinto en términos
de micropropagación, pues permite un manejo más simplificado; incluso han sido
definidos como órganos de perennidad (Krikorian, 1991b). Algunas especies
producen órganos de perennidad in vitro y cuando esto ocurre, se cuenta con los
medios para una multiplicación clonal a otro nivel; si esa característica es controlable,
es posible realizar por este medio la siembra directa o el almacenamiento de
germoplasma de ciertas plantas. La papa puede formar microtubérculos, los gladiolos
pueden formar tallos bulbosos; en ciertos lirios, cebollas, narcisos, jacintos, en
Dioscorea, etc se han encontrado bulbillos; y, por supuesto, las orquídeas han
producido protocormos (Krikorian, 1991b).
De acuerdo con el estado físico del medio de cultivo, tanto C. skinneri como C.
skinneri x C. maxima respondieron mejor en medio líquido que en medio semisólido
en lo que respecta a la producción de cuerpos protocórmicos, debido a que el medio
líquido en agitación promueve la división celular y mantiene disueltos lo polifenoles
que liberan los tejidos, además de que la oxigenación de las células y el alcance de
los nutrientes a éstas es más efectivo, pues la totalidad del explante está en contacto
con el medio, mientras que los explantes cultivados en medio semisólido contactan
con los nutrientes sólo en las secciones que están insertadas en el medio. El
70
aislamiento de meristemos de orquídeas generalmente tiene lugar en medios
semisólidos con la excepción de Cattleya; la propagación de protocormos
generalmente tiene lugar en medios líquidos (Homes et al., 1972)
El uso de 95-100 rpm de agitación en los medios de cultivo líquido se hizo para
que los explantes tuvieran la oportunidad de salir a la superficie en determinado
momento de las rotaciones, esto para un mejor intercambio gaseoso celular. En
medio líquido, algún método de soporte es necesario para los órganos o explantes
pequeños, los cuales de otra forma se sumergirían completamente bajo la superficie
del medio estático, los cuales morirían por la falta de aireación; muchos tejidos y
órganos, grandes y pequeños, también crecen bien en medio de cultivo líquido,
proveyendo agitación o movimiento (George, 1993).
71
Lindemann et al. (1970) y Morel (1970) obtuvieron cuerpos protocórmicos de
Cattleya en un período de 2 meses; si esto se compara con el tiempo requerido en C.
skinneri y C. skinneri x C. maxima, es claro que estos dos tipos de orquídea forman
los cuerpos protocórmicos en menor tiempo, independientemente del tipo de medio
de cultivo y del estado físico de éste. Esta respuesta es dependiente del factor
genético, del medio de cultivo utilizado y de las condiciones físicas en las que fueron
mantenidos.
72
maxima no se evidenció división espontánea, y los protocormos que fueron
seccionados con bisturí murieron en los días siguientes después de realizado el
fragmentamiento por daño del tejido. Los cuerpos protocórmicos están compuestos
de células meristemáticas, las cuales son muy sensibles, poseen paredes celulares
de tipo primario que se fracturan con facilidad liberando el contenido celular; el corte
del tejido produjo un daño celular que se extendió a las células vecinas produciendo
la muerte de todo el tejido. Debido a estos resultados, se evitó la práctica de
diseccionar el resto de explantes sobrevivientes y se dejó que alcanzaran la
brotación sin realizar ningún tipo de corte. La sensibilidad del tejido de los cuerpos
protocórmicos ya se había evidenciado con la muerte del explante que produjo
cuerpos protocórmicos en medio semisólido, y que se dañó en uno de los
subcultivos, sin haber realizado ningún tipo de corte.
73
La etapa de multiplicación se efectuó en la división de brotes adventicios, fase
que corresponde al proceso natural posterior a la formación de los cuerpos
protocórmicos. Incluso en el proceso de brotación se pudo verificar la sensibilidad de
los tejidos, pues la separación de brotes muy pequeños (menores de 0,5 cm)
significó siempre la muerte de los mismos, hecho que descartó de cierta forma la
posibilidad de que la muerte fuera por falta de oxigenación, ya que para ese
entonces la reducción del volumen en el medio de cultivo había sido realizada.
La sobrevivencia de los brotes con longitud de 1,5 cm o más al ser separados del
cuerpo principal de cuerpos protocórmicos significó que la diferenciación celular en
estos era tal que permitía a la estructura mantenerse por sí sola, y que el daño de
tejido ocasionado en la separación era mínimo. Una mayor longitud del brote
adventicio, implica una mayor diferenciación celular en los tejidos pues ya hay un
mayor crecimiento y desarrollo de las hojas y tallo, las células han alcanzado un
mayor grado de especialización y por tanto son más resistentes (Pierik, 19878;
Flores, 1998). Además, debe tomarse en cuenta que se trató de una simple
separación de los brotes, y no de cortes con bisturí, lo que reduce el daño celular. El
éxito de la separación de brotes con 1,5 cm o más de longitud se demostró en el
mantenimiento de la estructura vegetal y en la producción de más brotes adventicios
en la base de los explantes separados.
74
de la división celular. Además se añadió Ácido Giberélico (AG3), como un factor para
promover el crecimiento por elongación. Varias giberelinas, que son productos
complejos del metabolismo de hongos y de plantas superiores, son capaces de
intervenir en el crecimiento celular (Krikorian, 1991a). En general, las giberelinas
inducen elongación de internudos y el crecimiento de meristemos o yemas in vitro
(Pierik, 1987); esto significa que el papel del AG3 en el medio de multiplicación fue
inducir elongación de los brotes; sin embargo, tanto esta giberelina como los otros
reguladores de crecimiento se utilizaron en una sola combinación de acuerdo a lo
establecido por Lindemann et al.(1970) para el cultivo in vitro de Cattleya a partir de
meristemos, lo que no permite establecer comparaciones para determinar la
combinación óptima para C. skinneri y C. skinneri x C. maxima. Además, es probable
que parte de la actividad biológica del AG3 se haya perdido en el autoclavado (forma
en que fue esterilizado) (Arditti y Ernst, 1993)
75
En el índice de brotación no se contempló el número de brotes iniciales en el
explante (que depende del tamaño inicial de éste), sino del número de brotes nuevos
que se producen en determinado período de tiempo, lo que podría depender de la
interacción del genotipo con el medio de cultivo y las condiciones físicas de
crecimiento.
76
tengan las plantas en esta etapa, más obligadas se verán a prepararse a las
condiciones ex vitro.
77
En general, la propagación y el crecimiento son mejores en un medio en
movimiento que en un medio sólido (Pierik, 1987), pero el enraizamiento es exitoso
en medio semisólido, autores como Lindemann et al. (1970), Morel (1970), Reinert
and Mohr (1967), Scully (1967), Gutiérrez y Che-Huan (1994) han utilizado medio
semisólido para el enraizamiento de brotes de Cattleya.
78
7. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos bajo las condiciones experimentales en
que se llevó a cabo el proceso de micropropagación de C. skinneri y C. skinneri x C.
maxima, se desprenden las siguientes conclusiones:
79
e. Por los resultados obtenidos en este ensayo, el lavado de los ápices de C.
skinneri y C. skinneri x C. maxima en Ácido Cítrico (100 mg/l) antes de la
inoculación en cultivo aséptico no evitó ni redujo el efecto de la oxidación en los
mismos
80
lapso menor en medio Knudson C (1946) modificado.
81
8 RECOMENDACIONES
Para futuras investigaciones en cultivo de ápices de C . skinneri y C. skinneri x C.
maxima, se recomienda lo siguiente:
82
g. Realizar ensayos en diferentes volúmenes de medio de cultivo (menores a 50 ml)
en la etapa de introducción para comprobar la respuesta de los explantes en la
formación de cuerpos protocórmicos.
83
9. BIBLIOGRAFÍA
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87
ANEXO 1
88
ANEXO 2
89