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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y


BIOQUÍMICA

EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE EXTRACTOS


HIDROALCOHÓLICOS DE LOS FRUTOS DE Vaccinium
corymbosum (arándano) Y Vaccinium floribundum (mullaca)
SOBRE Staphylococcus aureus

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL


DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

AUTOR
ESCOBAR BOBADILLA, LUIS ENRIQUE
ORCID: 0000-0003-2124-9545

ASESOR
LEAL VERA, CÉSAR ALFREDO
ORCID: 0000-0003-4125-3381

TRUJILLO-PERÚ
2019
EQUIPO DE TRABAJO

AUTOR
Escobar Bobadilla, Luis Enrique
ORCID: 0000-0003-2124-9545
Universidad Católica Los Ángeles de Chimbote. Estudiante de pregrado
Trujillo, Perú.

ASESOR
Leal Vera, César Alfredo
ORCID: 0000-0003-4125-3381
Universidad Católica Los Ángeles de Chimbote. Facultad de Ciencias de
la Salud. Escuela profesional de Farmacia y Bioquímica. Trujillo, Perú.

JURADO
Díaz Ortega, Jorge Luis
ORCID: 0000-0002-6154-8913
Arteaga Revilla, Nilda María
ORCID: 0000-0002-7897-8151
Amaya Lau, Luisa Olivia
ORCID: 0000-0002-6374-8732

ii
JURADO EVALUADOR DE TESIS

Dr. Jorge Luis Díaz Ortega

Presidente

Mgtr. Nilda Maria Arteaga Revilla

Miembro

Mgtr. Luisa Olivia Amaya Lau

Miembro

Mgtr. Cesar Alfredo Leal Vera

Docente Tutor Investigador

iii
AGRADECIMIENTO

A Dios

Quien me dio la vida y las

fuerzas para seguir luchando y

poder concluir mis estudios y ser

una mejor persona.

A mis profesores

Quienes con su sabiduría me

otorgaron el conocimiento

necesario para ser un buen

profesional.

A mis compañeros

Con quienes compartí aulas e

hicimos una gran amistad, así

pasen los años siempre estarán en

mi memoria.

A todos ellos Muchas Gracias

iv
DEDICATORIA

Con mucho cariño a mis Padres y hermana

Por su confianza, amor, dedicación, sacrificio y apoyo en todas las

etapas de mi vida y hacer de mí, una persona de bien y motivándome

incondicionalmente en todo momento para no darme por vencido y

seguir hacia adelante.

A ustedes mi eterno agradecimiento

v
RESUMEN

El presente trabajo de investigación fué de tipo experimental, enfoque cuantitativo y

de corte transversal. Se realizó con el objetivo de evaluar el efecto antibacteriano in

vitro de los extractos hidroalcoholicos de Vaccinium corymbosum (arándano) y

Vaccinium floribundum (mullaca) sobre Staphylococcus aureus. Se trabajó con 30

placas con cultivos del microorganismo divididas en 6 grupos: grupo blanco

(solución salina fisiológica), grupo estándar farmacológico (ciprofloxacino 5µg), y

dos grupos experimentales al 50% y 75% tanto para el extracto hidroalcohólico del

fruto de arándano como para el extracto hidroalcoholico del fruto de mullaca.

Mediante el método de difusión de disco se evaluó el efecto antibacteriano de los

extractos hidroalcohólicos sobre la bacteria, a través del halo de inhibición. En los

resultados se observó presencia de halo de inhibición en ambas concentraciones de

los dos extractos hidroalcohólicos diferenciándose entre ellos significativamente

mediante la prueba de ANOVA (P˂0,05). En la comparación de grupos por medio de

la prueba T-student existe una diferencia significativa entre ellos, siendo la

concentración al 75% del extracto hidroalcohólico de arándano el que presentó

mayor efecto antibacteriano que el extracto de mullaca. Se concluye que ambos

extractos presentan efecto antibacteriano, siendo mayor en el extracto de arándano al

75%.

Palabras clave: Ciprofloxacino, efecto antimicótico, Vaccinium corymbosum,

Vaccinium floribundum.

vi
ABSTRACT

The present research work was experimental, quantitative and cross-sectional. It was

performed with the objective of evaluating the in vitro antibacterial effect of the

hydroalcoholic extracts of Vaccinium corymbosum (cranberry) and Vaccinium

floribundum (mullaca) on Staphylococcus aureus. We worked with 30 plates with

cultures of the microorganism divided into 6 groups: white group (physiological saline

solution), standard pharmacological group (ciprofloxacin 5µg), and two experimental

groups at 50% and 75% for both the hydroalcoholic extract of cranberry fruit and for

the hydroalcoholic extract of the fruit of mullaca. The antibacterial effect of

hydroalcoholic extracts on the bacteria was evaluated by means of the halo of

inhibition. In the results, presence of halo of inhibition was observed in both

concentrations of the two hydroalcoholic extracts, differing significantly between them

by means of the ANOVA test (P˂0.05). In the comparison of groups by means of the

T-student test, there is a significant difference between them, with the concentration

of 75% of the blueberry hydroalcoholic extract having the greatest antibacterial effect

than the mullaca extract. It is concluded that both extracts have an antibacterial effect,

being 75% higher in cranberry extract.

Keywords: Ciprofloxacin, antifungal effect, Vaccinium corymbosum, Vaccinium

floribundum.

vii
CONTENIDO
EQUIPO DE TRABAJO....................................................................................... ii
JURADO EVALUADOR DE TESIS..................................................................iii
AGRADECIMIENTO.......................................................................................... iv
DEDICATORIA .................................................................................................... v
RESUMEN ............................................................................................................ vi
ABSTRACT ......................................................................................................... vii
CONTENIDO ..................................................................................................... viii
ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................... ix
ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................... x
I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................1
II. REVISIÓN DE LA LITERATURA .................................................................6
2.1. Antecedentes ................................................................................................ 6
2.2. Bases Teóricas .............................................................................................. 8
III. HIPÓTESIS.....................................................................................................13
IV. METODOLOGÍA .......................................................................................... 14
4.1. Diseño de la investigación .......................................................................... 14
4.2. Población y Muestra ................................................................................... 15
4.3. Definición y operación de las variables ..................................................... 17
4.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos ....................................... 18
4.5. Plan de análisis ........................................................................................... 19
4.6. Matriz de consistencia… ........................................................................... 20
4.7. Principios éticos… .................................................................................... 21
V. RESULTADOS ............................................................................................... 22
5.1. Resultados .................................................................................................. 22
5.2. Análisis de resultados… ............................................................................ 26
VI. CONCLUSIONES..........................................................................................27
6.1. conclusiones ............................................................................................... 29
ASPECTOS COMPLEMENTARIOS ................................................................ 28
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................29
ANEXOS ...............................................................................................................37

viii
INDICE DE TABLAS

Tabla 01: Evaluación del efecto antibacteriano in vitro de los extractos

hidroalcohólicos de Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum

(mullaca) sobre Staphylococcus aureus ............................................................. 22

Tabla 02: Comparación del efecto antibacteriano in vitro de los extractos

etanólicos de Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum

(mullaca) sobre Staphylococcus aureus .............................................................. 23

ix
INDICE DE FIGURAS

Fig 1. Extracto hidroalcoholico del fruto de Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium

floribundum (mullaca) ................................................................................................................... 42

Fig 2. Cultivo de Staphylococus aureus .......................................................................... 42

Fig 3. Inóculo de Staphylococcus aureus semejante al tubo N° 0,5 del nefelómetro de

MacFarland ....................................................................................................................... 43

Fig 4. Siembra del inóculo de Staphylococus aureus en las placas de Agar Muller-

Hinton ............................................................................................................................... 43

Fig 5. Colocacion de los discos embebidos en la concentraciones de cada uno de los

extractos de Vaccinium corymbosum y de Vaccinium floribundum ................................. 44

Fig 6. Incubación de las placas Petri conteniendo los grupos experimentales, blanco y

estándar farmacológico por 24 horas a 37°C .................................................................... 44

Fig 7. Grupo blanco después de 24h de incubación a 37°C (control negativo)…............45

Fig 8. Grupo estándar farmacológico después de 24h de incubación a 37°C

(controlpositivo)…............................................................................................................45

Fig 9. Grupos experimentales después de 24 horas de incubación a 37°C… ...................46

x
I. INTRODUCCIÓN

En nuestro planeta existe una gran diversidad de plantas, las cuales son utilizadas como

alimentos para satisfacer una necesidad fisiológica como la nutrición. En la

antigüedad, muchos vegetales aparte de servir como alimento, han sido utilizados

como medicina para mitigar o curar ciertas enfermedades. Hoy en día aún existe gran

interés por las plantas medicinales a la que llaman medicina tradicional y que algunos

también llaman complementaria, alternativa u holística. La organización mundial de la

salud realiza esfuerzos para la racionalización del uso de la medicina tradicional debido

a que en varios países se ha verificado el uso de las plantas para el tratamiento de

diversas enfermedades (1,2,).

La necesidad del ser humano para aliviar sus enfermedades provoco el aumento en la

búsqueda de nuevas alternativas como el uso de plantas medicinales, ya que el ser

humano está prefiriendo el uso de remedios naturales que aquellos que son obtenidos

por manipulación química, además esta preferencia se debe por la carencia económica

en varios hogares, así como lo dificultoso que es acceder al servicio médico, etc, lo

cual demuestra que el uso de plantas medicinales aún sigue vigente (3,4).

En los países desarrollados y en vías de desarrollo aumento el uso de la medicina a

base de plantas originando el crecimiento de los mercados en la venta de plantas

medicinales. Lo cual indica que continúa la atracción hacia el estudio de las plantas

con poder terapéutico permitiendo que la fitoterapia tenga un gran apogeo (5,6).

El arándano es procedente de américa del norte y crece en forma silvestre. Son

arbustos que pertenecen al género Vaccinium de la familia de las Ericaceae, los frutos

son bayas pequeñas redondeadas, dulces o ácidas, jugosa, bien coloreada y es la

1
especie más cultivada. Los frutos tienen acción terapéutica debido a los principios

activos que posee como flavonoides, taninos, antocianinas, etc (7).

Vaccinium floribundum conocido como mortiño es una fruta silvestre de amplia

distribución geográfica encontrándose en todos los continentes a excepción de la

Antártida. El color negro del fruto se debe a las antocianidinas como polifenoles de

los cuales se reportó ácido gálico, proantocianidinas, miricetina, antocianinas que

proporcionan su actividad antioxidante. Estos frutos son considerados medicinales

ya que son usados para la diabetes, problemas digestivos, gripe, entre otros (8).

El ser humano siempre ha convivido con enfermedades que le han causado problemas

en su vida, esto es más frecuente debido a la falta de educación, de agua, vivienda,

mala higiene, pobreza, etc los cuales son factores sociales que incrementan la

proliferación patogénica de microorganismos como bacterias, hongos, parásitos y virus

y que en algunos casos son difíciles controlarlos y erradicarlos. Los microorganismos

patógenos son causantes de enfermedades infecciosas, responsables de la morbi-

mortalidad en los seres humanos (9).

Staphyloccosu aureus es una bacteria grampositiva de forma esférica, anaerobia

facultativa, catalasa positivo y no produce esporas, siendo la más importante en su

género. Es comensal de la piel que al encontrar las condiciones favorables provoca el

inicio de la infección por lo cual es considerado como un microrganismo oportunista.

La infección puede originarse por un corte en la piel produciendo un absceso,

forúnculo o foliculitis que luego podría diseminarse causando infecciones graves como

endocarditis, neumonía o sepsis. Esta bacteria es la causante de infecciones tanto a

2
nivel comunitario como hospitalario. El uso en los hospitales de catéteres intravenosos,

terapia inmunosupresora favorece el resurgimiento de infecciones por bacterias

grampositivas, especialmente Staphylococus aureus (10,11).

Hace ochenta años, Staphylococus aureus era fácilmente eliminada por penicilinas,

años más tarde se reportaron especies resistentes a dicho fármaco debido a la

producción de betalactamasas. Se sintetizó la meticilina, un derivado de la penicilina,

como antibiótico para esta bacteria, pero luego aparecieron cepas resistentes a

meticilina provocando serios problemas a nivel hospitalario. Muchas de estas bacterias

poseen cierta resistencia a otros antibacterianos como eritromicina, estreptomicina,

tetraciclina, clindamicina (11,12).

La resistencia a los antimicrobianos ocurre con el transcurso de los años debido a un

proceso de adaptación por parte de los microorganimos, sin embargo el uso

indiscriminado de antibióticos en el tratamiento de las enfermedades en hospitales, la

administración de medicamentos en infecciones que no lo requieren, la

automedicación, el uso inadecuado de la dosis, el incumplimiento adecuado del

tratamiento han acelerado este suceso. El efecto de una enfermedad causada por

microorganismos resistentes ocasiona una mayor duración de la enfermedad, y un

aumento en el costo del tratamiento de la infección, lo cual ocasiona una amenaza en

la economía de la población y un aumento en la mortalidad (13).

Debido al aumento de resistencia microbiana a ciertos antibióticos, esto conlleva a

buscar nuevas alternativas en el uso de plantas medicinales como Vaccinium

corymbosum y Vaccinium floribundum, las cuales poseen principios activos como

flavonoides, ácidos fenólicos entre otros que tienen poder terapéutico, útiles en el

tratamiento de las enfermedades del ser humano. Dichos frutos ejercen acción

3
antioxidante, antibacteriano y antifúngico causando la inhibición microbiana (14).

La presente investigación es considerada importante porque busca aportar nuevos

conocimientos sobre Vaccinium corymbosum y Vaccinium floribundum como opción

alternativa al tratamiento de enfermedades causadas por Staphylococcus aureus que

está produciendo resistencia a varios antibacterianos, siendo estos frutos de sabor

agradable, fáciles de conseguir en el Departamento de La Libertad, de bajo costo,

abriendo la posibilidad de que se continúen más estudios sobre sus principios activos

de esta planta. De esta manera se continúa motivando a la investigación de principios

activos presentes en las plantas medicinales.

Por lo mencionado anteriormente, el presente trabajo de investigación pretende

conocer si los extractos hidroalcoholicos de Vaccinium corymbosum y Vaccinium

corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum (Vaccinium floribundum tienen

efecto antibacteriano in vitro sobre Staphylococcus aureus que es la responsable de

infecciones intrahospitalarias en pacientes inmunodeprimidos. Por lo tanto se formuló

el siguiente problema de investigación: ¿Presenta efecto antibacteriano in vitro los

extractos hidroalcoholicos de los frutos de Vaccinium corymbosum (arándano) y

Vaccinium floribundum (mullaca) sobre Staphylococcus aureus?

4
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto antibacteriano in vitro de extractos hidroalcohólicos de los frutos

de Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum (mullaca) sobre

Staphylococcus aureus.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar el efecto antibacteriano in vitro de extractos hidroalcohólicos de los frutos

de Vaccinium corymbosum y Vaccinium floribundum al 50% y 75% sobre

Staphylococcus aureus.

Comparar el efecto antibacteriano in vitro de extractos hidroalcohólicos de los frutos

de Vaccinium corymbosum y Vaccinium floribundum al 50% y 75% sobre

Staphylococcus aureus utilizando un fármaco de referencia.

5
II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Antecedentes

Shen et al., en el 2015 en China examinaron el efecto antimicrobiano del extracto de

Vaccinium corymbosum (arándano) sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y

Salmonella enteritidis. Los niveles de compuestos fenólicos presentes en el arándano

tales como ácido clorogénico, ácido elágico, quercetina y quercetina – 3 –galactósido

se determinaron por medio del método Folin-Ciocalteau y el análisis por HPLC. Ellos

concluyeron que los cuatro compuestos fenólicos mencionados eran los responsables

del efecto inhibidor de las dos bacterias en estudio, siendo Listeria monocytogenes más

sensible al efecto antimicrobiano del extracto que Escherichia coli (15).

Angel et al., en el 2015, en Trujillo evaluaron el efecto del extracto de Vaccinium

corymbosum sobre el crecimiento de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Prepararon concentraciones de extracto acuoso al 50%, 75% y 100%. Mediante el

método de Kirby Bauer demostraron la sensibilidad bacteriana, para ello colocaron 50

µL de extracto de cada concentración vertido en las excavaciones de 6mm de diámetro

en placas con agar Muller-Hinton previamente sembrada en superficie por el inóculo

de las dos bacterias antes mencionadas por separado semejante al tubo N° 0,5 de

MacFarland, usaron como control al disco de gentamicina, los resultados indicaron

que a mayor concentración, mayor efecto, siendo Staphylococcus aureus más sensible

que Escherichia coli por presentar mayor halo de inhibición (16) .

Lalaleo et al., en el 2016, en Ecuador, evaluaron el efecto inhibitorio del extracto

alcohólico de mortiño (Vaccinium floribundum Kunth) sobre el Streptococcus mutans

ATCC 35668. Trabajaron con concentraciones del extracto al 25%, 50%, 75%, 100%,

como control positivo usaron a clorhexidina 2%, y al suero fisiológico como control

6
negativo. En los resultados el halo de inhibición de mayor tamaño fue a la

concentración del 25% del extracto alcohólico con un tamaño promedio de 13,11 mm.

Concluyeron que el extracto de este vegetal causa inhibición del Streptococcus

mutans, encontrándose mayor efecto a la concentración del 25% (17).

Buitrago et al., en el 2016 en Colombia, determinaron el efecto antimicrobiano in vitro

de Vaccinium macrocarpon sobre una cepa de Helicobacter pylori. Ellos usaron una

cepa pura y otra obtenida de un paciente con patología gastroduodenal. El cultivo se

realizó en agar base Columbia y Tripticasa de soya, por medio de la técnica de

inhibición de sensidisco se dispuso tres presentaciones de arándanos, y se incubo por

cinco días en microaerofilia. En los resultados no presenciaron halo de inhibición,

Concluyeron que no hay efecto por la técnica realizada (18).

Adrianzen et al., en Trujillo del año 2017, evaluaron el efecto del zumo Vaccinium

corymbosum sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli. La turbidez del inoculo

bacteriano se ajustó con solución salina fisiológica semejante al tubo n° 0,5 del

nefelómetro de MacFarland. Para la realización del ensayo determinaron la

concentración mínima bactericida y la concentración mínima inhibitoria. Obtuvieron

efecto inhibitorio de zumo de arándano por presentar una menor turbidez del medio

que contuvo a E. coli en 50µL al 100% v/v y para la concentración mínima bactericida

evidenciaron que el zumo difunde sobre la bacteria a la concentración del 100% v/v

mostrando un halo de 4mm de diámetro (19).

Sachún et al., en el 2019, Trujillo, evaluaron el efecto antibacteriano del extracto

acuoso del fruto de Vaccinium corymbosum sobre Staphylococcus aureus ATCC

25923. Prepararon concentraciones de extracto acuoso al 25%, 50%, 75% y 100%. Se

utilizó el inóculo de la bacteria a una turbidez semejante al tubo n° 0,5 del nefelómetro

7
de MacFarland y por el método de Kirby Bauer de difusión en disco se demostró la

sensibilidad bacteriana. En los resultados, obtuvieron que a mayor concentración,

mayor era el tamaño del halo de inhibición, siendo mayor a la concentración del 100%

con un promedio de 29,2mm, pero no logro superar el tamaño promedio de halo de

inhibición de mupirocina con 38,3mm (20).

Ávila et al., en el 2019, en la ciudad de Lima, determinaron el efecto antibacteriano in

vitro de Vaccinium corymbosum sobre la Prevotella intermedia, ellos usaron

concentración de su extracto al 25%, 50%, 75%, 100%. Por medio del método de Kirby

Bauer demostraron la sensibilidad bacteriana. Trabajaron con un inoculo de su bacteria

semejante al tubo número 0,5 del nefelómetro de MacFarland. En sus resultados

observaron halos de inhibición los cuales fueron mayores en las concentraciones de

75% y 100% (21).

2.2. Bases teóricas

Planta medicinal

Es aquella parte de una planta, ya sea hoja, raíz, fruto, flor, etc que posee sustancias
(22)
con acción farmacológica para mejorar la salud de los seres vivos .

Principio activo

Son sustancias químicas producidas por las plantas medicinales con acción terapéutica
(23).

Extracto alcohólico

Extracto adquirido de un órgano vegetal, ya sea por percolación, maceración usando

alcohol etílico para la extracción de los principios activos solubles en dicho solvente.

Posteriormente el alcohol es eliminado por un procedimiento físico (24).

Vaccinium corymbosum

8
 Descripción botánica

Son arbustos, nativa de América del Norte, puede llegar a crecer hasta una altura de

2,5m. Sus ramas poseen hojas simples y alternas, de forma elíptica lanceolada, de un

color verde oscuro ligeramente dentadas. Sus flores son acampanadas de un tono

blanco, algunos cultivares son de color rosa. Los frutos son bayas que contienen

semillas en su interior, estos conformen van madurando, van adquiriendo un color

negro azulado. Es la especie más cultivada en Perú (25).

 Clasificación Taxonómica

Reino Vegetal

División Magnoliophytas

Subdivisión Angiosperma

Clase Dicotiledonea o magnoliopsida

Orden Ericales

Familia Ericaceae

Género Vaccinium

Especie Vaccinium corymbosum (26)

 Principios activos del arándano

Entre los principios activos con propiedades terapéuticas del arándano tenemos:

Flavonoides, como quercetina, astragalina, hiperósido.

Taninos: catequicos, proantocianidinas.

Ácidos fenólicos que provienen del ácido cinámico, como ácido cafeico, ácido

clorogénico.

Antocianos tales como la malvidina, petunidina, cianidina.

Iridoides como son onotropeina y asperulosido.

9
Ácidos orgánicos: ácido málico, ácido cítrico y ácido quínico (27).

 Propiedades curativas:

Tienen un poder depurativo razón por la cual se lo usa para problema renal, y además

tiene la capacidad de ser antimicrobiano, lo cual le hace efectivo para combatir la

cistitis. Previene la inflamación de la vejiga, próstata, uretra, así como también por

medio de la acidificación de la orina ayuda a disolver los cálculos renales o arenillas.

Debido a sus propiedades antiinflamatorias, son útiles para tratar enfermedades de la

piel,, ulceras en la cavidad oral, acné. También disminuye el nivel de glucosa en

sangre. Debido a su abundancia en flavonoides, antocianinas ayudan a prevenir

problemas de la visión. Son ricas en vitamina C, lo cual les permite tener la capacidad

de antioxidantes, gracias a esta propiedad ayuda a reducir la aparición de

enfermedades degenerativas como alzheimer (27).

Vaccinium floribundum

 Descripción botánica

Esta especie es un arbusto que mide aproximadamente entre 2 a 2,5m de altura, las

hojas son pequeñas, se distribuyen en forma alterna y son de forma elíptica a oval

lanceolada cuyos bordes son levemente aserrados, sus flores son pequeñas, con

corola de color blanco, rosado a rojo. Los frutos son bayas lisas, esferoidales de un

tono azulado oscuro (28).

 Clasificación taxonómica

Reino Vegetal

División Magnoliophytas

Subdivisión Angiosperma

Clase Dicotiledonea o magnoliopsida

10
Orden Ericales

Familia Ericaceae

Género Vaccinium

Especie Vaccinium floribundum (28)

 Principios activos

El color oscuro de la cáscara del fruto se debe al elevado contenido de antocianidinas

de los cuales se ha encontrado la presencia de ácido gálico, quercetina,

proantocianidina, miricetina que son derivados del ácido clorogénico e

hidroxinámico (28).

Staphylococcus aureus

 Taxonomía

Reino Bacteria

Filo Firmicutes

Clase Bacilli

Orden Bacillales

Familia Staphylococcaceae

Género Staphylococcus

Especie Staphylococcus aureus (29)

 Características

Son bacterias esféricas grampositivas, con diámetro de 0,5 a 1,5 µm, crecen en forma

de racimo, son consideradas anaeróbicas facultativas. Poseen la enzima catalasa, lo

cual les diferencia del género Streptococcus y Enterococcus que son catlasa negativo.

Dentro de las especies de su mismo género, Staphylococus aureus es coagulasa

posítivo, mientras que Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus

11
son coagulasa negativo (30).

 Factores de virulencia

El daño causado por esta bacteria se debe a sus factores de virulencia como lo son:

Adherencia microbiana

S. aureus para que pueda causar infección, debe adherirse al tejido del huésped, y

esto lo consigue por medio de proteínas presentes en su pared celular que permiten

la unión al tejido del hospedero. Se han descrito varias proteínas de superficie entre

las más estudiadas están, las proteínas que se unen a los receptores del colágeno, a la

fibronectina, y las proteínas de unión al fibrinógeno, de esta manera se favorece la

unión al tejido del huésped y el inicio de la infección (31).

Persistencia del microorganismo

Cuando la bacteria se unió al tejido del huésped, esta empieza a producir una biocapa

que la protege de los mecanismo defensivos del huésped, y de los antibióticos, lo

cual esclarece la dificultad de eliminarla en infecciones asociadas a dispositivos

protésicos (31).

Estrategias ante los mecanismos defensivos del hospedador

Staphylococus produce una proteína ubicada en la pared celular llamada proteína A

que se a la fracción Fc de la inmunoglobulina G inactivando la función opsonizante.

También produce una proteína capaz de inhibir la quimiotaxis, o puede producir

citotoxinas que le servirán para destruir a los glóbulos blancos polimorfonucleares.

Este microorganismo es capaz de producir enzimas como proteasas, lipasas,

hialuroniadas, nucleasa, para la invasión y destrucción del tejido (31).

12
III. HIPOTESIS

H1 : Los extractos hidroalcohólicos de Vaccinium corymbosum “arándano” y

Vaccinium floribundum “mullaca” presentan efecto antibacteriano in vitro

sobre Staphylococcus aureus.

Ho : Los extractos hidroalcohólicos de Vaccinium corymbosum “arándano” y

Vaccinium floribundum “mullaca” no presentan efecto antibacteriano in vitro

sobre Staphylococcus aureus.

13
IV. METODOLOGÍA

4.1. Diseño de la investigación:

El presente trabajo corresponde al tipo de una investigación experimental, de enfoque

cuantitativo y corte transversal, para lo cual se formaron los siguientes grupos:

Grupo Control Negativo (Blanco): Se utilizaron 05 placas Petri con medio de cultivo

de Agar Muller-Hinton y el cultivo de Staphylococcus aureus. Se utilizó la técnica de

Kirby Bauer. Se colocó 4 discos conteniendo solución salina fisiológica, y se incubó

por 24h en una temperatura de 35°C – 37°C, posteriormente se realizó la lectura de los

medios de cultivo.

Grupo Estándar Farmacólogico: Se utilizó 05 placas como medio de cultivo de Agar

Muller-Hinton y el cultivo de Staphylococus aureus. Se hizo uso de la técnica de Kirby

Bauer. Se colocó 4 discos conteniendo solución de ciprofloxacino (5ug/disco), y se

incubó por 24 h. en una temperatura 35°C – 37°C. Posteriormente se realizó la lectura

de los halos de inhibición.

Grupo experimental 01:

Se utilizaron 05 placas Petri con medio de cultivo de Agar Muller-Hinton y el cultivo

de Staphylococus aureus. Se utilizó la técnica de Kirby Bauer, se colocaron 4 discos

embebidos de extracto hidroalcohólico de Vaccinium corymbosum al 50%. Se incubó

por 24h a una temperatura de 35°C - 37°C, luego se realizó la lectura de los halos de

inhibición. El mismo procedimiento se realizó para el extracto hidroalcoholico de

Vaccinium floribundum.

Grupo experimental 02:

Se utilizaron 05 placas Petri con medio de cultivo de Agar Muller-Hinton y el cultivo

de Staphylococus aureus. Utilizando la técnica de Kirby Bauer se colocó 4 discos

14
embebidos de extracto hidroalcohólico de Vaccinium corymbosum al 75%. Se incubó

por 24h a una temperatura de 35°C - 37°C, luego se realizó la lectura de los halos de

inhibición. El mismo procedimiento se realizó para el extracto hidroalcoholico de

Vaccinium floribundum.

4.2. Población y Muestra:

Población vegetal:

Recolección:

La planta de Vaccinium corymbosum fue recolectada de la provincia de Virú, mientras

que la planta de Vaccinium floribundum fue recolectada de Pataz, ambas plantas fueron

transportadas en bolsas de primer uso para su identificación taxonómica en el

Herbarium Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo.

Selección:

Los frutos de arándano y mullaca fueron retirados de la planta para luego ser procesados.

Muestra vegetal:

Fruto de Vaccinium corymbosum (Arándano) y fruto de Vaccinium floribundum

(mullaca).

Criterios de inclusión:

Se tuvo en cuenta los siguientes criterios: El fruto de V. corymbosum y V. floribundum

estén enteros.

Deben estar maduros.

El fruto trabajado se cultive en la misma zona en la que pertenece la muestra.

Criterios de exclusión:

No se tuvo en cuenta los siguientes criterios:

15
La planta recientemente haya sido fumigada.

La planta haya sido atacada por plagas.

Material Biológico:

Población: Staphylococcus aureus

Muestra: Cultivo de Staphylococcus aureus

Criterios de inclusión:

Cultivos rejuvenecidos

Cultivos no contaminados.

Criterios de exclusión:

Cultivos con presencia de contaminantes.

16
4.3. DEFINICIÓN Y OPERACIÓNALIZACIÓN DE LAS VARIABLES

Variable Definición conceptual Definición operacional Indicadores Escala de


medición
Variable Independiente:

Extractos hidroalcohólico de Extracción del principio activo Se utilizó concentraciones Concentraciones de: Variable
cualitativa
Vaccinium corymbosum y utilizando como solvente el etanol. del extracto hidroalcohólico. 50% y 75% nominal

Vaccinium floribundum.

Variable Dependiente

Efecto antibacteriano sobre Es la susceptibilidad que tiene el Se determinó por medio de Diámetro de halos Variable

Staphylococcus aureus microbio frente a un fármaco o a halos de inhibición. de inhibición en cuantitativa

un principio activo de un milímetros. de razón.

vegetal.

17
4.4. Técnicas e instrumentos de recolección de datos:

Material vegetal y obtención del extracto:

Se lavó los frutos de arándano y mullaca con agua destilada, para luego desinfectarlo

con hipoclorito de sodio al 0,5%. Luego se enjuago con agua destilada estéril.

Preparación del extracto:

De los frutos que fueron seleccionados se pesó aproximadamente 1000g y se

homogenizaron en una licuadora durante 10 segundos. Luego se maceró con 1000 ml

de etanol al 70% en un frasco de vidrio color ámbar. Se mezcló mediante agitación

mecánica por 10 minutos y luego se guardó en oscuridad a temperatura ambiente por

7 días, con agitación mecánica diaria por cinco minutos. Después de haber transcurrido

el tiempo de maceración, se filtró el líquido al vacío con papel filtro whatman Nº 1. A

este líquido filtrado obtenido se colocó en bandejas de vidrio y se llevó a evaporar el

alcohol a una estufa de circulación de aire a 40ºC hasta obtener un extracto blando de

arándano. A partir de este extracto blando se prepararon concentraciones de 50% y

75%. Estas concentraciones preparadas fueron guardadas en frascos de color ámbar en

refrigeración a una temperatura de 4ºC hasta su uso (32, 33).

Rejuvenecimiento del cultivo

Para el rejuvenecimiento del cultivo de Staphylococcus aureus se utilizó el medio de

agar tripticasa de soya estéril y se incubó a 37ºC por 24 horas.

Preparación del inóculo:

El inoculo del microorganismo fue preparado con solución salina estéril hasta obtener

una suspensión equivalente a una turbidez al tubo Nº 0,5 del estándar de Mc Farland
(34).

18
Sembrado del microorganismo

Después de 15 minutos al ajuste de la turbidez del inoculo, se sumergió un hisópo

estéril en la suspensión del inóculo de 0,5 de McFarland, y se retiró el exceso del

inóculo rozando el hisopo por la pared interior del tubo de ensayo por encima del nivel

del líquido. Luego se realizó el sembrado del inoculo sobre la superficie del agar

Muller Hinton girando la placa Petri en tres direcciones. Se dejó secar la placa por 5

minutos (35, 36).

Método de difusión de discos

El método más común en la evaluación de la actividad antimicrobiana es el ensayo

Kirby – Bauer. Se prepararon discos de papel de filtro estéril con un diámetro de 6 mm, lo cuales

fueron sumergidos dentro de cada una de las concentraciones del extracto hidroalcohólico y después

con aguja estéril se colocó cuatro discos por placa de modo que estén a una distancia aproximada de

25 mm uno del otro (36). Se usaron como grupos controles, discos de ciprofloxacino y solución salina

fisiológica estéril. Posteriormente las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas.

Medición de los halos de inhibición:

Se midió la zona de inhibición de cada disco contra una superficie bajo luz reflejada. Se

midió el diámetro de la zona incluyendo los 6mm del disco, con un vernier sobre el

respaldo de la placa Petri. Una lectura de 6mm indica que no hay zona de inhibición
(35,36).

4.5. PLAN DE ANALISIS

Los resultados son presentados en tablas, utilizando el programa Excel Microsoft y el

programa estadístico ANOVA y T-Student.

19
4.6. MATRIZ DE CONSISTENCIA

Título de la Formulación Objetivos Hipótesis Tipo de investigación Variables Definición Indicadores y Plan de
Investigación del problema y diseño operacional escala de medición análisis

Objetivo general
Evaluar el efecto El extracto se
Hipótesis Variable
¿Presenta antibacteriano in vitro obtuvo a partir
Efecto Alternativa (H1) Independiente
efecto de extractos del órgano de
antibacteriano Los extractos El presente Extracto
antibacteriano hidroalcohólicos de los un vegetal en Dos
in vitro de hidroalcohólicos trabajo de hidroalcohólico
in vitro los frutos de Vaccinium contacto con concentraciones
2 extractos de Vaccinium investigación de Vaccinium
extractos corymbosum etanol al 70% al 50% y 75 %
hidroalcohólic corymbosum fue de tipo corymbosum y
hidroalcoholico (arándano) y Vaccinium Variable
os de los frutos Vaccinium “arándano” y experimental, cualitativa,
s de los frutos floribundum Prueba
de Vaccinium floribundum (mullaca) Vaccinium de corte nominal
de Vaccinium estadística
corymbosum sobre Staphylococcus floribundum transversal y Se determinó
corymbosum
(arándano) y aureus “mullaca” enfoque mediante halo ANOVA y
(arándano) y Variable T-student
Vaccinium Objetivos específicos presentan efecto cuantitativo. de inhibición Medición del
Vaccinium Dependiente
floribundum Determinar el efecto antibacteriano in que se diámetro del
floribundum Efecto
(mullaca) antibacteriano in vitro de vitro sobre presentó halo de
(mullaca) sobre antibacteriano
sobre extractos Staphylococcus alrededor del inhibición en
Staphylococcus in vitro sobre
Staphylococus hidroalcohólicos de los aureus disco que milímetros (mm)
aureus? Staphylococcus
aureus frutos de Vaccinium Hipotésis Nula contiene las
aureus
corymbosum y (Ho) concentracion
Vaccinium floribundum Los extractos es del extracto.
al 50% y 75% sobre hidroalcohólicos
Staphylococcus aureus de Vaccinium
corymbosum
Comparar el efecto “arándano” y
antibacteriano in vitro de Vaccinium
extractos floribundum
hidroalcohólicos de los “mullaca” no
frutos de Vaccinium presentan efecto
corymbosum y antibacteriano in
Vaccinium floribundum vitro sobre
al 50% y 75% sobre Staphylococcus
Staphylococcus aureus aureus
utilizando un fármaco de
referencia

20
4.7. PRINCIPIOS ÉTICOS

En la presente investigación, se tuvo presente las normas de bioseguridad en

laboratorio, garantizando la correcta manipulación del microorganismo desde la

recepción hasta la culminación de la investigación (37).

También se tuvo presente los principios éticos descritos en el código de Ética para la

investigación, versión 001 de la ULADECH, tales como:

Justicia: El investigador debe ejercer un juicio razonable, ponderable y tomar las

precauciones necesarias para asegurarse de que sus sesgos, y las limitaciones de sus

capacidades y conocimiento, no den lugar o toleren prácticas injustas (38).

Integridad científica: La integridad o rectitud deben regir no sólo la actividad

científica de un investigador, sino que debe extenderse a sus actividades de enseñanza

y a su ejercicio profesional (38).

21
V. RESULTADOS

5.1 RESULTADOS

Tabla 1. Evaluación del efecto antibacteriano in vitro de los extractos hidroalcohólicos

de Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum (mullaca) sobre

Staphylococcus aureus

GRUPOS Halos de Significancia


Inhibición
en mm. P

X ± DS

Blanco (Solución Salina fisiológica) 6.0 ± 0.0

Estándar (Ciprofloxacino) 21.2 ± 1.06 0.000*

E.H Vaccinium corymbosum al 50% 10.2 ± 0.77

E.H Vaccinium floribundum al 50% 8.8 ± 0.7

E.H Vaccinium corymbosum al 75% 11.9 ± 0.55

E.H Vaccinium floribundum al 75% 10.3±0.80

*ANOVA (P<0.05).
Leyenda:
X: promedio
D.S.: desviación estándar
E.H: Extracto Hidroalcohólico

22
Tabla 2. Comparación del efecto antibacteriano in vitro de los extractos etanólicos de

Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum (mullaca) sobre

Staphylococcus aureus.

Grupos Tamaño de los halos de inhibición en Significancia


mm. de los 2 grupos comparados
(Valor P)
X ± DS

Estándar (Ciprofloxacino) vs 21.2 ± 1.06 10.2 ± 0.77 0.000*


E.H V. corymbosum al 50%

Estándar (Ciprofloxacino) vs 21.2 ± 1.06 8.8 ± 0.7 0.000*


E.H V. floribundum al 50%

Estándar (Ciprofloxacino) vs 21.2 ± 1.06 11.9 ± 0.55 0.000*


E.H V. corymbosum al 75%

Estándar (Ciprofloxacino) vs 21.2 ± 1.06 10.3±0.80 0.000*


E.H V. floribundum al 75%

E.H V. corymbosum al 50% vs 10.2 ± 0.77 8.8 ± 0.7 0.046*


E.H V. floribundum al 50%

E.H V. corymbosum al 75% vs 11.9 ± 0.55 10.3±0.80 0.038*


E.H V. floribundum al 75%

E.H V. corymbosum al 50% vs 10.2 ± 0.77 11.9 ± 0.55 0.024*


E.H V. corymbosum al 75%

E.H V. floribundum al 50% vs 8.8 ± 0.7 10.3±0.80 0.029*


E.H V. floribundum al 75%

Prueba T para comparación de medias (*p ˂ 0,05) Leyenda:


X : Promedio
D.S.: Desviación estándar
E.H.: Extracto hidroalcohólico

23
5.2 ANÁLISIS DE RESULTADOS

El presente trabajo de investigación es de tipo experimental y fue realizada para

determinar el efecto antibacteriano in vitro de los extractos de los frutos de Vaccinium

corymbosum y de Vaccinium floribundum sobre Staphylococcus aureus, usando como

patrón de referencia el disco de ciprofloxacino 5 µg/disco. Las concentraciones

ensayadas de los extractos fueron de 50% y 75%.

En la Tabla 01 se aprecia los promedios y desviación estándar de cada uno de los

grupos de estudios, también se muestra la significancia entre los grupos utilizando la

prueba ANOVA con un valor P =0.000 (<0.05) lo que significa diferencia

estadísticamente significativa entre los grupos, y confirma la hipótesis alternativa. En

el grupo blanco donde se utilizó el solvente (solución salina fisiológica) se observa que

no hubo inhibición del crecimiento bacteriano, por esto la medida de los halos es de

6mm (correspondiente al diámetro del disco) este grupo sirvió como control de calidad

microbiológico del agar, de los materiales y del solvente de dilución.

Con respecto al grupo Estándar farmacológico Ciprofloxacino se observa un diámetro

de inhibición de 21.2 ± 1.06 mm. este valor se encuentra dentro de lo esperado según

el reporte del Instituto Nacional de Salud que señala un valor mayor de 21mm. frente

a S. aureus. La acción bactericida de ciprofloxacino se asocia a la actuación sobre la

topoisomerasa bacteriana II (ADN girasa) y la topoisomerasa IV las cuales son

imprescindibles para la duplicación, transcripción, y reparación del material genético


(39).

La formación de biopelículas constituyen uno de los principales mecanismos de

resistencia bacteriana que se observan actualmente; ciprofloxacino puede inhibir la

formación de biopelículas (como ocurre en S. aureus) e incluso dañar las biopelículas

24
al afectar el espesor y el tamaño de las monocapas de una manera dependiente de la

dosis (40).

Todos los grupos experimentales tanto de V. corymbosum y V. floribundum

presentaron efecto antibacteriano esto puede explicarse por lo reportado por Shen et

al., que identifican en Vaccinium compuestos fenólicos como ácido clorogénico, ácido

elágico, quercetina y quercetina-3-galactósido que mostraron un efecto inhibidor del

crecimiento dependiente de la dosis, esto explicaría que entre los grupos

experimentales fue el correspondiente a V. corymbosum al 75% el que presentó los

halos de inhibición con mayor diámetro con un valor de 11.9 ± 0.55 mm de longitud.

La actividad antimicrobiana observada probablemente se deba a los altos niveles de

polifenoles en los extractos. Se ha informado que los compuestos fenólicos que

contienen grupos hidroxilo inhiben la actividad enzimática de los microorganismos (15,


41).

En la Tabla 02 se observan las comparaciones de los promedios y la significancia

utilizando la prueba T – Student donde los valores de significancia para todos los

grupos muestran un p<0.05, es decir que en todas las comparaciones realizadas existen

diferencias estadísticamente significativas, es necesario resaltar que en la comparación

del estándar Ciprofloxacino con los extractos de Vaccinium en todos los casos el

antibacteriano mostró un efecto significativamente superior, lo mismo ocurre entre el

extracto de V. corymbosum al 75% que muestra un efecto superior a todos los demás

extractos, seguido por el extracto de V. floribundum al 75% esto podría explicarse por

lo reportado por Llivisaca et al., quienes manifiestan en sus estudios que las bacterias

gramnegativas son más susceptibles a los extractos de hojas y frutos de mortiño que

las bacterias grampositivas (42).

25
El extracto de V. corymbosum al 50% muestra un halo de inhibición mayor que el de

V. floribundum a la misma concentración, este resultado estaría asociado a lo expuesto

por Samad et al que indican que los ácidos fenólicos como los ácidos gálico y cafeico

son inhibidores potenciales del metabolismo de la prolina en patógenos y los

compuestos fenólicos pueden formar complejos con proteínas en la membrana externa

de los microorganismos lo que puede dar lugar a la inhibición o muerte del patógeno.

Y estos presentan una mayor concentración en los frutos de V. corymbosum (42).

26
VI. CONCLUSIONES

 Se evaluó el efecto antibacteriano in vitro de los extractos hidroalcohólicos de

Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium floribundum (mullaca) sobre

Staphylococcus aureus.

 Los extractos hidroalcohólicos de los frutos de Vaccinium corymbosum y

Vaccinium floribundum al 50% y 75% presentaron efecto antibacteriano in vitro

sobre Staphylococcus aureus. Siendo el extracto de V. corymbosum al 75% el de

mayor efecto.

 La comparación del efecto antibacteriano in vitro de los extractos hidroalcohólicos

de Vaccinium corymbosum y Vaccinium floribundum al 50% y 75% sobre

Staphylococcus aureus mostraron mejores resultados cuanto más alta fue la dosis

(75%) sin embargo utilizando un fármaco de referencia (Ciprofloxacino) los

extractos no demostraron una respuesta equivalente o similar a este.

27
ASPECTOS COMPLEMENTARIOS

- Determinar la concentración mínima inhibitoria y máxima inhibitoria del extracto

hidroalcoholico de los frutos de Vaccinium corymbosum (arándano) y Vaccinium

floribundum sobre Staphylococcus aureus.

- Realizar investigaciones en animales de experimentación para comprobar si se

obtiene resultados similares con el estudio in vitro.

28
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36
ANEXOS

37
ANEXO 1

Valores del diámetro de los halos de inhibición en milímetros (mm) del grupo estándar
farmacológico (ciprofloxacino )
Estándar
Farmacológico D1 D2 D3 D4
(ciprofloxacino ) (mm) (mm) (mm) (mm)
Placa 1 21 20 20 21
Placa 2 21 20 22 21
Placa 3 20 20 21 23
Placa 4 24 21 22 21
Placa 5 22 21 21 22
Promedio 21,20
Desviación estándar 1,06
Leyenda: E.H.: Extracto hidroalcólico
D : Disco

ANEXO 2

Valores del diámetro de los halos de inhibición en milímetros (mm) del extracto
hidroalcoholico de Vaccinium corymbosum (50%) sobre Staphylococcus aureus
E.H.
Vaccinium D1 D2 D3 D4
corymbosum (50%) (mm) (mm) (mm) (mm)
Placa 1 10 10 11 11
Placa 2 10 09 09 10
Placa 3 10 09 10 10
Placa 4 10 11 12 10
Placa 5 11 10 11 10
Promedio 10,2
Desviación estándar 0,76
Leyenda: E.H.: Extracto hidroalcólico
D : Disco

38
ANEXO 3

Valores del diámetro de los halos de inhibición en milímetros (mm) del extracto
hidroalcoholico de Vaccinium corymbosum (75%) sobre Staphylococcus aureus
E.H.
Vaccinium D1 D2 D3 D4
corymbosum (75%) (mm) (mm) (mm) (mm)
Placa 1 12 12 11 13
Placa 2 12 12 11 12
Placa 3 12 11 12 12
Placa 4 12 12 13 12
Placa 5 11 12 12 12
Promedio 11,9
Desviación estándar 0,55
Leyenda: E.H. = Extracto hidroalcólico
D : Disco

ANEXO 4

Valores del diámetro de los halos de inhibición en milímetros (mm) del extracto
hidroalcoholico de Vaccinium floribundum (50%) sobre Staphylococcus aureus
E.H.
Vaccinium D1 D2 D3 D4
floribundum (50%) (mm) (mm) (mm) (mm)
Placa 1 08 09 09 10
Placa 2 09 08 08 08
Placa 3 09 09 09 10
Placa 4 09 08 08 08
Placa 5 09 09 10 09
Promedio 8,80
Desviación estándar 0,69
Leyenda: E.H.: Extracto hidroalcólico
D : Disco

39
ANEXO 5

Valores del diámetro de los halos de inhibición en milímetros (mm) del extracto
hidroalcoholico de Vaccinium floribundum (75%) sobre Staphylococcus aureus
E.H.
Vaccinium D1 D2 D3 D4
floribundum (75%) (mm) (mm) (mm) (mm)
Placa 1 10 11 10 12
Placa 2 11 10 10 10
Placa 3 10 10 10 09
Placa 4 11 12 10 10
Placa 5 10 11 10 09
Promedio 10,30
Desviación estándar 0,80
Leyenda: E.H.: Extracto hidroalcólico
D : Disco

40
ANEXO 6

CERTIFICACIÓN DE LA PLANTA

41
ANEXO 7

Fig 1. Extracto hidroalcoholico del fruto de Vaccinium corymbosum y Vaccinium

floribundum

Fig 2. Cultivo de Staphylococus aureus

42
Fig 3. Inóculo de Staphylococcus aureus semejante al tubo N° 0,5 del nefelómetro de

MacFarland

Fig 4. Siembra del inóculo de Staphylococus aureus en las placas de Agar Muller- Hinton

43
Fig 5. Colocación de los discos embebidos en las concentraciones de cada uno de los

extractos de Vaccinium corymbosum y de Vaccinium floribundum

Fig 6. Incubación de las placas Petri conteniendo los grupos experimentales, blanco y

estándar farmacológico por 24 horas a 37°C

44
Fig 7. Grupo blanco después de 24h de incubación a 37°C (control negativo)

Fig 8. Grupo estándar farmacológico después de 24h de incubación a 37°C (control

positivo)

45
Fig 9. Grupos experimentales después de 24 horas de incubación a 37°C

a) Vaccinium floribundum 50% b) Vaccinium floribundum 75%

c) Vaccinium corymbosum 50% d) Vaccinium corymbosum 75%

46

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