These Thym
These Thym
RH
R
RH
22
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
La proprit antiradicalaire des flavonodes est troitement lie leur structure, en
particulier au phnomne de rsonance lectronique stabilisant exerc par les noyaux
aromatiques, cette activit ncessite :
Structure ortho-dihydroxyphnolique du cycle B (3',4' dihydroxystructure), cette
structure est importante pour l'activit antiradicalaire des flavonodes possdant un
htrocycle satur.
La double liaison C2-C3 conjugue avec la fonction 4 oxo qui est responsable de la
dlocalisation des lectrons, en amliorant ainsi la capacit antiradicalaire.
Les groupements hydroxyles libres en C3 et C5 (Ami et al, 2003)
A titre d'exemple ; la querctine et la myrictine rpondent tous ces critres ncessaires
pour avoir une activit antiradicalaire efficace et importante (Middleton et al, 2000)
Figure 7 : Critres structuraux essentiels pour avoir une bonne activit antiradicalaire des
flavonodes (Ami et al, 2003)
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
A
B
C
2
3
4
5
6
7
8
2'
3' 4'
5'
6'
23
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
B / Proprits chlatrices des ions mtalliques :
Les ions mtalliques sont ncessaires pour le fonctionnement des processus biochimiques et
physiologiques cellulaires, mais dans certains cas et lorsque leur mcanisme d'action n'est pas
bien contrl ces mmes ions peuvent tre l'origine d'une peroxydation lipidique, un stress
oxydatif, ou une blessure des tissus, titre d'exemple Cu+ est un stimulateur de la
peroxydation des LDL (Tiqwari, 2001).
Grce leur structure chimique spcifique, les flavonodes peuvent facilement chlater les
ions mtalliques en crant des composs complexes inactifs (Maleev et Kunti, 2007)
La chlation des ions mtalliques ncessite trois sites principaux :
Site situ entre le groupe 3' OH et le groupe 4' OH du cycle B
Site situ entre le groupe 3OH et 4 C=O de lhtrocycle C
Site situ entre le groupe 5OH du cycle A et le groupe 4C=O de lhtrocycle C
Figure 8 : Principaux sites impliqus dans la chlation des ions mtalliques (Me+) (Tiqwari,
2001)
O
O
OH
OH
OH
O
H
Me+n
Me+n
Me+n
1
2
3
4
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
A
B
C
24
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
C / Proprits antibactriennes :
La thrapeutique des infections bactriennes se base principalement sur lusage des
antibiotiques. La prescription grande chelle et parfois inapproprie de ces agents a entran
la slection de souches multirsistantes do limportance dorienter les recherches vers la
dcouverte de nouvelles voies qui constituent une source dinspiration de nouveaux
mdicaments base des plantes, sous forme de mtabolites secondaires dont les composs
phnoliques, sont toujours utiliss dans lindustrie alimentaire et cosmtique et comme agents
antimicrobiens en mdecine populaire.
Les polyphnols notamment les flavonodes et les tannins sont reconnus par leur toxicit
vis- -vis des microorganismes. Le mcanisme de toxicit peut tre li l'inhibition des
enzymes hydrolytiques (les protases et les carbohydrolases) ou d'autres interactions pour
inactiver les adhesines microbiens, les protines de transport et d'enveloppe cellulaire
(Cowan, 1999)
D / Proprits anticancreuses :
Le cancer se prsente habituellement comme une tumeur forme d'une masse cellulaire qui
est l'aboutissement d'une srie de transformation pouvant se drouler pendant plusieurs
annes, donc la cancrognse est un processus complexe multi-squentiel menant une cellule
de l'tat sain un tat prcancreux et finalement un stade prcoce de cancer (Pincemail et
al, 1999)
Depuis longtemps, on associe le cancer et le type d'alimentation, de nombreux chercheurs
ont tudi le rle des nutriments dans le dveloppement des cancers. Plus rcemment des
recherches exprimentales suggrent que les flavonodes sont parmi les substances
susceptibles de retarder voire d'empcher l'apparition de certains cancers, tout en rduisant
d'une manire spcifique les risques d'en avoir chez les sujets humains (Decloitre, 1993 ;
Hertog, 1996)
25
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
Des tudes montrent que certains flavonodes particulirement ; lutoline, querctine,
kaempfrol, apignine, taxifoline inhibent d'une faon marque la lipogense des cellules
cancreuses, d'autres flavonodes sont plutt capables d'induire l'apoptose.
Certains flavanols (pigallocatchine-3-gallate) reprsentent des effets cytotoxiques sur les
cellules cancreuses de prostate, ces effets sont corrls avec leur capacit inhiber les
enzymes cls lipogniques i.e. FAS (Fatty Acid Synthase) (Brusselmans et al, 2005).
Les travaux raliss par Mahmoud et al (2000) in (Depeint et al, 2002) montraient que la
curcumine permet de prvenir la formation des tumeurs spontanes induites gntiquement,
ce mme flavonode rduit l'apparition des tumeurs de la peau induites chimiquement. La
querctine et la rutine sont les deux flavonodes les plus conseills pour prvenir l'apparition
du cancer de l'appareil gastro-intestinal tandis que l'apignine avec la querctine ont la
capacit inhiber la phase de mtastase. Toute fois Caltagirone et al (2000) in (Depeint et
al, 2002) signalaient que linhibition des diffrents stades de dveloppement de cancer est
plutt assure par tous les flavonodes.
L'activit anticancreuse des flavonodes est assure par l'intervention de plusieurs
mcanismes :
pigeage des radicaux libres
Inhibition du mtabolisme d'acide arachidonique
Formation d'un complexe inactif avec le carcinogne (Hertog, 1996)
Prvention de l'activation des mtabolites carcinognes
Inhibition de la prolifration des cellules cancreuses
Arrt du cycle cellulaire des cellules cancreuses
Induction de l'apoptose
Inhibition des processus d'angiognse (Ren et al, 2003)
26
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
E / Proprits anti inflammatoires :
Une inflammation par dfinition est une raction de dfense immunitaire strotype du
corps une agression (infection, brlure, allergie) qui se manifeste par une rougeur, un
gonflement, une sensation de chaleur, une douleur qui semble pulser (Wikipdia, 2008).
Au cours de l'inflammation, des produits bactriens dclenchent la production d'une grande
quantit d'oxyde nitrique (NO) dans les macrophages et d'autres cellules sous l'action d'oxyde
nitrique synthase inducteur (iNOS) (Hmlinen et al, 2007), bien que la libration de (NO)
est trs importante pour maintenir la dilatation des vaisseaux sanguins (vasodilatation) mais
des fortes concentrations peuvent conduire aux dommages oxydatifs (Nijveldt et al, 2001),
car une fois que le NO est form il se peut qu'il va ragir avec l'anion superoxyde conduisant
la formation de peroxynitrite qui provoque l'endommagement des macromolcules
cellulaires. Cependant une production en excs de NO durant une inflammation chronique
rsulte au dveloppement du cancer (Tsai, 2004)
De nombreuses tudes semblent indiquer que les flavonodes possdent des proprits anti
inflammatoires et qu'ils sont capables de moduler le fonctionnement du systme immunitaire
par inhibition de l'activit des enzymes qui peuvent tre responsables des inflammations, ils
peuvent aussi moduler l'adhsion des monocytes durant l'inflammation athrosclrosique en
inhibant l'expression des mdiateurs inflammatoires (Gonzlez-Gallego et al, 2007) d'autres
flavonodes sont capables d'inhiber l'histamine (Kim et al, 2004).
Les flavones et les flavonols sous forme glycosyle ou libre comme la querctine,
kaempfrol, myrectine ont une activit inhibitrice de COX (Cyclooxygnase) (Tapas et al,
2008)
27
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
F / Proprits antivirales :
La stratgie de recherche d'un compos antiviral consiste mesurer la rduction de
l'infection virale des cellules en culture, une substance peut agir diffrents niveaux du cycle
viral :
au niveau de l'adsorption du virus sur la cellule hte
au niveau de la pntration du virus dans la cellule hte
au niveau la de rplication du virus et la synthse des protines virales
au niveau de l'assemblage et de la sortie du virus hors de la cellule hte
L'activit antivirale des flavonodes contre HIV peut tre lie directement par leurs effets
sur les enzymes responsables de son rplication (HIV-1 reverse transcriptase ou HIV-1
integrase) par railleurs d'autres flavonodes montraient une activit antivirale contre le virus
d'influenza, HIV-1, HIV-2 (Bylka et al, 2004). Querctine, apignine, catchine et
hesperdine sont parmi les flavonodes caractriss par leurs proprits antivirales contre onze
types de virus. Les flavonodes aglycones pourvus dun groupement hydroxyle libre en C3 ont
montr une bonne activit antivirale, les flavanes sont gnralement plus efficaces que les
flavones et les flavanones contre HIV-1 et HIV-2 (Tapas et al, 2008)
G / Proprits antiallergiques :
Ces effets antiallergiques sont attribus l'influence des flavonodes sur la production de
lhistamine. En effet, les flavonodes inhibent les enzymes, telles que l'AMP cyclique
phosphodiesterase et ATPase Ca+ dpendante, responsables de la libration de l'histamine
partir des monocytes et des basophiles. Par exemple, l'ATPase Ca+ dpendante dgrade
l'ATP produisant ainsi de l'nergie afin de faciliter l'absorption du calcium par les membranes
cellulaires, ce qui favorise la libration de l'histamine stocke dans les vsicules. En inactivant
cette enzyme, la querctine a montr un potentiel d'action suprieur celui du cromoglycate
de sodium utilis comme mdicament en empchant la libration de l'histamine et d'autres
substances endognes qui causent l'asthme (Marfak, 2003)
28
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
H / Les flavonodes sont des produits nutraceutiques :
Le terme nutraceutique a t intervenu en 1979 par Steph De Felice (Lin et Weng, 2006), il
s'agit d'une appellation commerciale labore par les industriels qui rsulte de la contraction
de "Nutrition" et de "Pharmaceutique" (Bietrix, 2004). Les nutraceutiques sont des
composs qui n'ont pas une valeur calorique mais qui ont un rle fondamental pour ce qui
concerne la prvention de certaines pathologies (Teissedre et al, 2007)
Le rle nutraceutique des polyphnols s'inscrit dans le cadre de ce que l'on appelle la
nouvelle pharmacie qui consiste faire un traitement prventif et non curatif, il vaut mieux
que le mdicament soit dj prsent dans l'organisme prt la dfense apport sous forme des
aliments fonctionnels capables de procurer des bienfaits physiologiques dmontrs ou de
rduire les risques des maladies chroniques, en plus de remplir leurs fonctions nutritionnelles
de base dont la consommation des fruits et des lgumes riches en composs bioactifs peut
tre une stratgie de prvention raliste contre de nombreuses maladies majeures. Les produits
nutraceutiques fondamentaux des plantes sont les composs phnoliques, particulirement les
flavonodes en raison de leurs proprits bnfiques sur la sant humaine.
I / Biodisponibilit des flavonodes :
Les effets sant des polyphnols dpendent essentiellement de leur biodisponibilit ; cette
dernire qui signifie la part d'un nutriment prsent dans un aliment qui est effectivement
assimile par l'organisme (Wikipdia, 2008)
Selon Wiseman (1999) la biodisponibilit absolue (%) correspond la proportion des
molcules qui entrent dans la circulation sanguine sous leur forme intacte aprs leur
consommation en passant travers la paroi intestinale et le foie.
29
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
a / Absorption : tous les flavonodes l'exception de catchine (flavanol) sont prsents dans
les plantes sous forme glycosyle (lis aux sucres par des liaisons osidiques) seuls les
aglycones peuvent tre absorbs par l'intestin grle, tandis que les glycosides sont hydrolyss
tout d'abord en aglycones par l'intermdiaire de la microflore colique qui dispose des enzymes
capables de cliver les liaisons osidiques (Wiseman, 1999 ; Urquiaga et Leighton, 2000 ;
Ming, 2007), cette mme flore microbienne mtabolise au mme temps les aglycones librs.
Des quantits considrables de catchines polymriques connus sous le nom de
proanthcyanidines sont prsents dans lalimentation, des tudes montrent que les formes
dimres et trimres de catchine sont susceptibles d'tre absorbs tandis que les polymres de
degr de polymrisation lev ne peuvent pas tre absorbs par la paroi intestinale qu'aprs
leurs dgradation (Hollman, 2001)
b / Mtabolisme : deux compartiments considrablement importants pour le mtabolisme des
composs phnoliques :
les tissus (foie et les reins) : ou des enzymes de biotransformation agissent
directement sur les flavonodes aglycones ainsi que sur des mtabolites coliques
absorbs, ces enzymes sont principalement localiss au niveau du foie, des reins, ainsi
quau niveau de lintestin grle.
Colon : o la microflore colique dgrade les flavonodes aglycones librs (aprs
hydrolyse des glycosides) par ouverture de leur htrocycle aux diffrents endroits
selon le type de flavonode concern :
Les flavonols : sont dgrads en acides phnylacetiques et acides
phnylpropioniques
Les flavanols : produisent les valerolactones (noyau benznique avec une chane
latrale de cinq atomes de carbones) et des acides phnylpropioniques
Les flavones et les flavanones : produisent des acides phnylpropioniques
30
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
Ces acides sont encore mtaboliss aux drivs des acides benzoques, les groupements
hydroxyles des mtabolites gnrs subissent une conjugaison par acide glucuronique,
sulfate, ou par glycine (Hollman, 2001). L'limination des mtabolites de polyphnols se
fait par deux voies essentielles d'excrtion ; soit par voie biliaire (Manach, 1998) ou par
voie urinaire.
Figure 9 : Principaux compartiments impliqus dans le mtabolisme des flavonodes
(Hollman, 2001)
31
Synthse bibliographique Chapitre II Les composs phnoliques
G / Autres proprits des flavonodes :
Protection des plantes contre les radiations UV
Sont impliqus dans les processus de dfense de la plante contre les infections
bactriennes et virales
Agissent comme des pigments ou des co-pigments
Modulation de la distribution d'auxine
Fonctionnent comme des signaux molculaires de reconnaissance entre les bactries
symbiotiques et les lgumineuses afin de faciliter la fixation de lazote molculaire
Rgulation de l'longation des tiges
Interviennent dans la maturit des fruits
Sont l'origine des gots amers et astringents afin de repousser les animaux
herbivores (Park et Cha, 2003 ; Subsamanian et al, 2007 ; Yang et al, 2008)
32
Matriel et mthodes
Chapitre I
Etude phytochimique
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
I-1 / Matriel vgtal :
Le matriel vgtal est constitu des parties ariennes de Thymus vulgaris et Rosmarinus
officinalis. Les feuilles du thym ont t cueillies en mai 2008 de la rgion dAin Smara tandis
que Les feuilles et les sommits fleuries du romarin ont t rcoltes en mois de mars 2008
de luniversit de Constantine. Aprs schage une temprature ambiante et labri de la
lumire solaire, afin de prserver au maximum lintgrit des molcules, le matriel vgtal
de chacune des deux espces est broy grossirement dans un moulin lectrique.
I-2 / Extraction des flavonodes :
Suivant le protocole dextraction dcrit par (Merghem et al, 1995), le matriel vgtal
broy (100 g) est soumis une extraction par macration dans le mlange thanol / eau
(30/70 : v/v) pendant 72 heures avec renouvellement de solvant chaque 24 heures et
agitation de temps en temps. Les macras sont runis puis ils sont filtrs sur un papier
filtre. Les filtrats sont vapors presque sec au moyen dun vaporateur rotatif. Le rsidu
sec est repris dans 100 ml deau distille bouillante (lintrt de lutilisation de leau distille
bouillante cest pour assurer la rcupration des composs rests accols la paroi du ballon
dvaporation), aprs une dcantation de toute une nuit on rcupre la phase limpide qui va
subir des affrontements par des solvants de polarit croissante :
Affrontement par ther de ptrole
Affrontement par actate dthyle
Affrontement par MEC (mthyle thyle ctone)
33
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
Ces affrontements se font dans des ampoules dcanter, la phase aqueuse et le solvant
sont agits nergiquement puis laisss au repos pendant 30 minutes, la phase aqueuse (qui
est au fond de lampoule) et la phase charge de molcules spcifiques sont rcupres
sparment. Les diffrentes phases rcupres (actate dthyle, MEC, phase eau rsiduelle)
sont vapores sec puis reprises par 10 ml du mthanol, les extraits obtenus sont ensuite
stocks une temprature ambiante jusqu' leur utilisation.
Figure 10 : Protocole d'extraction des flavonodes (Merghem et al, 1995)
34
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
I-3 / La chromatographie analytique sur couche mince :
I-3-1 / Principe :
Le principe de la chromatographie repose sur lentrainement dun chantillon dissous par
une phase mobile travers une phase stationnaire (Wikipdia, 2008)
I-3-2 / Mode opratoire :
a / Prparation de la phase stationnaire : La chromatographie sur couche mince a
t ralise sur des plaques pr-tales de gel de silice et sur des plaques de
polyamide (DC6), quant ces dernires sont prpares en mlangeant 10 g de poudre
de polyamide dans 50 ml dthanol, aprs talement du gel sur des plaques en verre et
schage, la phase stationnaire sera prte lutilisation.
b / Prparation de la phase mobile : La phase mobile est constitue par un mlange
de solvants organiques. Pour cela, diffrents systmes solvants ont t essays pour
dfinir ceux qui donnent les meilleures sparations.
Tableau VI : Les diffrents systmes solvants utiliss pour la CCM de gel de polyamide
CCM sur gel de polyamide
Systmes solvants Proportions Rfrences
Systmes
essays
Tol/MEC/EtOH (2/1/1) (v/v/v) Mehibel, 2006
Tol/MEC/EtOH/EP (2/1/1/1) (v/v/v/v) Mehibel, 2006
MeOH/H
2
O/A actique (18/1/1) (v/v/v) Kaabouche, 2007
MeOH/H
2
O/A actique (95/5/5) (v/v/v) Bhat et al, 2004
Tol/MeOH/EtOH (4/3/3) (v/v/v) Aurangzeb et al, 2005
Systmes
choisis
Tol/MeOH/EtOH (4/3/3) (v/v/v) Aurangzeb et al, 2005
MeOH/H
2
O/A actique (95/5/5) (v/v/v) Bhat et al, 2004
35
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
Tableau VII : Les diffrents systmes solvants utiliss pour la CCM de gel de silice
Les systmes solvants choisis sont utiliss comme des luants des phases stationnaires (silice
et DC6), leurs vapeurs doivent saturer latmosphre de la cuve ceci impose dutiliser une cuve
bien ferme.
c / Le dpt : le dpt se fait avec des tubes capillaires en verre usage unique dune
faon perpendiculaire et linairement. Chaque phase doit tre dpose en solution
dilue dans le mthanol, on peut effectuer plusieurs dpts successifs du mme analyte
en mme endroit, cette pratique permet de concentrer lanalyte (Sine, 2003)
d / Dveloppement des plaques : chaque plaque est dpose en position verticale ou
lgrement incline dans la cuve pralablement sature par les vapeurs du systme
solvant appropri, lchantillon tudier sera plus ou moins entrain par la
progression par capillarit de la phase mobile vers le haut de la plaque (Sine, 2003)
e / Rvlation : si les constituants sont colors, ils seront directement visible sur la
plaque, sinon la rvlation peut se faire soit aux UV ou bien par des mthodes
chimiques :
CCM sur gel de silice
Systmes solvants Proportions Rfrences
Systmes
essays
Actate dthyle /acide
formique/acide
actique/H
2
O
(100/11/11/27)
(v/v/v/v)
Male et al, 1998
Actate
dthyle/MeOH/H
2
O
(100/13.5/10)
(v/v/v)
Male et al, 1998
Systmes
choisis
Actate
dthyle/MeOH/H
2
O
(100/13.5/10)
(v/v/v)
Male et al, 1998
36
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
*Rvlation aux UV : qui permet de mettre en vidence sous forme des taches des substances
qui absorbent les UV entre 254 nm et 365 nm.
*Rvlation par des mthodes chimiques : ces mthodes consistent mettre en contacte de
la plaque un ractif plus ou moins spcifique qui donne un produit color par raction
chimique avec les substances rvler (Latifou, 2005)
f / Identification des flavonodes : le comportement dune molcule particulire dans
un systme donn est exprim par sa fluorescence sous UV et par son Rf (le rapport
de la distance parcourue par cette molcule sur celle parcourue par la phase mobile
cest dire le front du solvant) qui est compris entre 0 et 1.
*Structure -Rf
La distance de migration des substances dpend essentiellement de leur polarit :
Les polyhydroxyflavones ont des faibles valeurs de Rf (0,00-0,25)
Les oligohydroxy et les oligomthoxyflavones ont des valeurs de Rf comprises entre
(0,3-0,5)
Les flavanones, les flavonols, mthoxyflavones ont les valeurs les plus leves de Rf
(0,5-0,75) (Bandyukova et Shinkarenko, 1973)
Tableau VIII : La relation entre le Rf et la structure des flavonodes (Bandyukova et
Shinkarenko, 1973)
Structure flavonique Rf
Augmentation des (OH) Diminution du Rf
Mthylation des groupements (OH) Augmentation des valeurs de Rf
Actylation Augmentation des valeurs de Rf
Glycosylation Diminution des valeurs de Rf due principalement de
lintroduction de nouveaux groupements (OH)
37
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
*Structure-fluorescence :
Lexamen en lumire ultraviolette est la mthode la plus utilise pour la dtermination de la
structure des flavonodes, le tableau 9 rsume la relation qui peut exister entre la structure
dun compos et sa fluorescence sous UV.
Tableau IX : La relation entre la fluorescence et la structure des flavonodes (Lahouel, 2005)
Spot color Types de flavonodes
Noir Flavonols 5, 6, 7, tri OH libres
Flavonols 5, 7, 8, tri OH librs
Brun noir 3-OH absent ou 3-OH substitu
Violet Flavones 5-OH et 4 OH
Flavones 3-OR et 5 OH ,4-OH
Flavones 6 ou 8 OH
Chalcones
Dihydroflavonols
Isoflavones
Flavanones
Bleu claire (fluorescent) Flavones sans 5-OH libre
Flavonols sans 5-OH libre avec 3 OH
substitu
Jaune terne
Jaune
Fluorescence orange
Flavonols 3- OH libre avec ou sans 5-OH
libre
Jaune vert brillant 5 OH libre ou 5 OH substitu
Jaune fluorescent Flavonols avec 3OH libres
Aurones
Chalcone
flavanones
Jaune ple dihydroflavonols
38
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
I-4 / Mise en vidence des flavonodes :
Afin de mettre en vidence la prsence des flavonodes dans nos extraits, un test simple et
rapide au AlCl
3
a t ralis (Latifou, 2005) pour ce test nous avons prpar une solution
thanolique de chlorure d'aluminium (1%) en dissolvant 1g d'AlCl
3
dans 100 ml d'thanol, la
solution est ensuite stocke 4c puis pulvrise sur le chromatogramme de gel de silice, ce
dernier qui a t dvelopp au pralable dans le systme solvant (actate
d'thyle/mthanol/eau) (100/13,5/10). Aprs schage le chromatogramme sera directement
observ dans le visible.
I-5 / Dosage des composs phnoliques :
Le contenu des composs phnoliques de nos extraits est estim par la mthode de Folin
ciocalteu (Adesegun et al, 2007)
1ml d'extrait de l'chantillon
5ml du ractif de Folin ciocalteu (dilu dix fois)
4ml d'une solution de bicarbonate de sodium (0.7M)
Agiter vigoureusement
Incuber pendant 2h une temprature ambiante
Lire l'absorbance 765 nm, le total des composs phnoliques est dtermin selon
l'quation suivante T=C.V/M
T : Reprsente le total des composs phnoliques (mg EAT / g dextrait sec de la plante)
C : Concentration dextrait thanolique quivalente lacide tannique, obtenue partir de la
courbe d'talonnage (mg/ml)
V : le volume d'extrait thanolique (ml)
M : poids sec d'extrait thanolique de la plante (g)
39
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
I-6 / Dosage des flavonodes :
Les flavonodes contenus dans les extraits thanoliques du thym et du romarin sont estims
par la mthode d'AlCl
3
(Ayoola et al, 2008)
1ml d'une solution thanolique d'AlCl
3
(2%) est rajout 1ml de l'extrait de la plante.
Aprs 30 minutes d'incubation une temprature ambiante, l'absorbance du mlange
est lue 420 nm, la querctine est utilise comme un standard, la quantit des
flavonodes est estime en mg EQ/g d'extrait sec de la plante.
I-7 / Techniques chromatographiques de sparation des flavonodes :
I-7-1 / La chromatographie sur colonne :
La chromatographie sur colonne est une mthode de sparation des constituants dun
mlange par migration dans un dispositif constitu de deux phases :
La phase stationnaire : cest le support solide, qui est la colonne de polyamide
(DC6), elle est monte dans le moins polaire des solvants utiliss qui est le tolune
dans notre cas.
La phase mobile : reprsente le solvant dlution utilis qui est en gnrale un
mlange de deux solvants, lun polaire et lautre apolaire.
Aprs dissolution des phases actate dthyle et MEC de Thymus vulgaris dans le
mthanol, le mlange est additionn une quantit de polyamide (DC6), vapor sec ce qui
conduit lobtention dune poudre solide qui est introduite dlicatement dans la colonne puis
fractionne avec le gradient (tolune/mthanol) de polarit croissante, llution doit tre
poursuite jusquau mthanol pur. A chaque fois des fractions de 25 ml sont prleves.
40
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
Les fractions collectes sont soumises au contrle chromatographique sur couche mince, puis
rvles aux UV (254 et 365 nm) ce qui en permet de rassembler les fractions prsentant des
similitudes.
I-7-2 / La chromatographie sur papier :
La chromatographie prparative sur papier Wathman n 3 est une mthode de sparation
dont le principe repose sur les phnomnes de partage. La phase mobile est le plus souvent un
solvant organique et leau, la phase stationnaire est constitue par leau elle-mme absorbe
par la cellulose du papier ou lie chimiquement elle. Dans cette technique, une quantit
importante des deux phases mlanges de MEC et actate dthyle de Rosmarinus officinalis
est dpose sur le bord dune bande de papier de chromatographie, cet chantillon est absorb
par le papier ; ce qui signifie que les molcules interagissent avec ce dernier et quelles auront
tendance rester au mme endroit. Le papier est ensuite tremp dans le systme solvant
(acide actique/eau) (50/50 : v/v) plac dans une cuve bien ferme, pendant que lluant
descend le long du papier par capillarit, il rencontre lchantillon qui commence descendre
avec celui-ci. Les diffrentes substances de lchantillon migrent diffrentes vitesses selon
quelles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. La chromatographie sur papier
demande un certain temps, gnralement plusieurs heures, une fois que cest fini, c'est--dire
quand le solvant est arriv en bas du papier ce dernier est retir de la cuve, on laisse vaporer
le solvant. Aprs dveloppement des chromatogrammes, les bandes correspondent aux
composs sont dlimites sous UV, dcoupes et lues dans le mthanol.
I-8 / La spectrophotomtrie :
I-8-1 / Dfinition :
La spectrophotomtrie est une mthode analytique quantitative qui consiste mesurer
labsorbance ou la densit optique dune structure chimique donne en solution, plus cette
espce est concentre plus elle absorbe la lumire dans les limites de proportionnalit
nonces par la loi de Beer Lambert (Wikipdia, 2008)
41
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
I-8-2 / Principe :
Le principe repose sur labsorption de la lumire par les espces chimiques, lappareil
comporte une source de lumire blanche, un systme dispersif permettant de slectionner
la longueur donde de la radiation et un systme dtecteur permettant la mesure de
lintensit lumineuse de la radiation monochromatique traversant la solution. Le
spectrophotomtre effectue une comparaison entre les intensits lumineuses incidentes et
transmises et permet par lintermdiaire dun circuit lectronique dafficher labsorbance
A= .l.c
Pour valider la loi de Beer-Lambert il faut travailler en lumire monochromatique, les
solutions utilises doivent tre dilues, homognes, et le solut ne doit pas donner de
ractions sous leffet de la lumire incidente.
I-8-3 / Spectres UV-Visible des flavonodes :
Les flavonodes peuvent tre considrs comme des pigments qui absorbent trs
fortement les radiations UV, par consquent la spectroscopie UV-Vis reste l'outil principal
pour l'analyse structurale des flavonodes. Les flavones et flavonols sont caractriss en
majorit par deux bandes dabsorption majeures dans la rgion UV-Visible.
Les flavones et les flavonols hautement oxygns ont tendance d'absorbance vers les
longueurs d'ondes les plus longues en entrainant un dplacement du spectre vers linfra
rouge. La mthylation ou la glycosylation des groupements hydroxyles des flavonodes
rsulte gnralement d'un dplacement hypsochromique de la bande I.
42
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
Tableau X : Principales caractristiques des spectres UV-Visible des flavonodes (Markham,
1982)
Bande II Bande I Types de flavonodes
250-280
250-280
250-280
245-275
275-295
230-270
(Faible intensit)
230-270
270-280
310-350
330-360
350-385
310-330
(paulement pic 320)
300-330
Epaulement
340-390
380-430
465-560
Flavones
Flavonols substitus en C3
Flavonols
Isoflavones
Isoflavones (5-desoxy-6,7-
dioxygns)
Flavanones et
dihydroflavonols
Chalcones
Aurones
Anthocyanes
43
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
I-8-4 / Etude spectrale des flavonodes :
Aprs la collection des extraits flavoniques suite lutilisation des techniques
chromatographiques de sparation (chromatographie sur colonne pour Thymus vulgaris
et chromatographie sur papier pour Rosmarinus officinalis) les composs isols sont
analyss par mesure de leur spectre dabsorption UV-Vis dans le mthanol, ainsi que leur
dplacement bathochromique, hypsochromique, hyperchromique suite laddition des
ractifs spcifiques (Andr et al, 1976 ; Van Den Broucke et al, 1982 ; Voirin , 1983 ;
Dordevi et al, 2000)
Premire srie :
Deuxime srie :
Troisime srie :
Figure 11 : Protocole d'tude spectrale des flavonodes en prsence des diffrents ractifs
44
Matriel et mthodes Chapitre I Etude phytochimique
Tableau XI : Principales caractristiques spectrales UV-Visible des flavonodes en prsence
des diffrents ractifs (Markham, 1982)
Ractifs Dplacements en nm
Bande I Bande II
Interprtations
MeOH 310-350 250-280
330-360 250-280
350-380 250-280
Flavones
Flavonols (3-OH substitu)
Flavonols (3-OH libre)
NaOH +45 65 BI avec stabilit
dintensit
+50 60 avec diminution
dintensit
Faible dplacement avec
diminution dintensit
Absence de pic entre 320-335
Apparition dun pic entre BI
et BII
Transformation de BI en une
inflexion
4OH
3,4-di OH
4 OMe
7-OR
7-OH
5-OH
AlCl
3
+MeOH +20 45
+60
5-OH
3-OH
AlCl
3
+HCl / AlCl
3
-30 45
-10
-20
3,4 di OH
3 ,4-OH,OMe
3,4,5-tri OH
AlCl
3
+HCl /MeOH +35 55
+17 20
5-OH
5-OH
NaOAc / MeOH +20 80
Dplacement trs faible
Diminution dintensit avec le
temps
Spectre se dcompose avec le
temps
7-OH
7-OR
6,7 ; 7,8 ou 3 ,4-di-OH
5, 6,7 ; 5, 7,8 ou 3,3,4-tri
OH
NaOAc +H
3
BO
3
/ MeOH +12 36
+5 10
3,4-di OH
6,7 ou 7,8 di OH
45
Chapitre II
Etude des activits biologiques
Matriel et mthodes ChapitreII Etude des activits biologiques
II-1 / Activit antiradicalaire des flavonodes :
Les radicaux libres peuvent tre considrs comme des lments trs importants pour la vie
de lorganisme suite limplication de leurs effets bnfiques, par exemple les radicaux
oxygniques exercent des actions critiques sur les signaux de traduction, et sur les gnes de
transcription, les cellules phagocytaires (macrophages) utilisent galement les espces
ractives drives de loxygne (ROS) pour combattre les agents infectieux (bactries et
virus). Cependant ces mmes radicaux peuvent causer des dgts oxydatifs cellulaires,
endommagement des tissus et mme la mort des cellules et le dveloppement des processus
pathologiques (Fotsing Matene, 2005 ; Wang et al, 2008)
Les antioxydants naturels sont prsents dans lalimentation ; pour la plupart se sont des
composs phnoliques qui possdent au moins un noyau aromatique, contenant un ou
plusieurs substituants, en effet cette proprit antioxydante est en relation directe avec la
structure de ces molcules (Cosio et al, 2006). Lactivit antioxydante des flavonodes peut
tre mesure par lutilisation dune mthode simple, rapide et facile mettre en uvre ; cest
la mthode de DPPH, dont le DPPH est un radical libre, stable, qui possde une bande
dabsorbance 517 nm, employ pour valuer lactivit antioxydante des composs pures ou
de mlange complexe, la mthodologie est base sur la dcroissance de labsorbance dune
solution mthanolique de DPPH suite laddition de lantioxydant (Bernardi et al, 2007). On
utilise comme principes actifs les extraits flavoniques du thym et du romarin qui sont
respectivement en nombre de six et de trois, ces extraits sont vapors sec afin de connaitre
leurs poids sec puis repris dans le mthanol de telle sorte avoir des concentrations de 5
mg/ml pour chacun.
46
Matriel et mthodes ChapitreII Etude des activits biologiques
Lactivit antiradicalaire de ces extraits est mesure selon la mthode dcrite par (ES Safi
et al, 2007)
25l de lextrait tester
2.5ml dune solution mthanolique de DPPH (0.004%)
La densit optique DO est mesure par le spectrophotomtre SHIMADZU 517 nm,
aprs 30 minutes dincubation une temprature ambiante et lobscurit, la
dcroissance de labsorbance est convertie en pourcentage dactivit Scavenger selon
lquation suivante :
Activit Scavenger (%) = (A contrle A chant / A contrle) x 100
A contrle : Absorbance du contrle
A chant : Absorbance des flavonodes tests
II-2 / Evaluation de l'activit antibactrienne des flavonodes :
Le test de susceptibilit a t effectu selon la mthode de diffusion des disques dcrite par
(Dulger et Gonuz, 2004 ; Parekh et Chanda, 2007 ; Rota et al, 2008)
Le support microbien est compos dEscherichia coli, Staphylococcus aureus,
Enterobacter spp qui ont t isoles de produits pathologiques provenant de laboratoire de
bactriologie de l'hpital universitaire de Constantine.
Repiquage des espces bactriennes : les diffrentes espces bactriennes ont t
repiques par la mthode des stries, puis incubes 37 C afin d'obtenir des colonies
isoles qui vont servir la prparation de linoculum.
47
Matriel et mthodes ChapitreII Etude des activits biologiques
Prparation de l'inoculum : des colonies bien spares des espces bactriennes
concernes ont t prleves l'aide d'une anse de platine strile et homognises
dans 10 ml de bouillon nutritif puis portes lincubation pendant (18-24) heures
37C.
Prparation des disques : des disques de papier Wathman n1 de 6 mm de diamtre,
striles (strilisation 120C pendant 15 min par autoclavage), sont chargs de
l'extrait naturel tester, des disques imprgns de mthanol sont galement utiliss qui
vont servir de tmoin ngatif.
Prparation des milieux de culture : la glose de Muller Hinton strile prte
lusage a t coule dans des boites de ptrie striles de 90 mm de diamtre.
L'paisseur de la glose est de 2 mm rpartie uniformment dans les boites. Ces
dernires doivent tre sches 30 min une temprature ambiante du laboratoire avant
leur emploi.
Ensemencement : des boites de ptrie striles pralablement coules, sont
ensemences par talage l'aide d'un rteau strile, l'ensemencement s'effectue de telle
sorte assurer une distribution homogne des bactries.
A l'aide d'une pince strile, les disques de papier filtre contenant les produits tester
sont dposs la surface de la glose inocule au pralable.
L'activit antibactrienne est dtermine en terme de diamtre de la zone d'inhibition produite
autour des disques aprs 24 h d'incubation 37 C.
48
Rsultats et discussion
Chapitre I
Etude phytochimique
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-1 / Extraction :
L'extraction des parties ariennes de Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis par
macration dans le mlange thanol / eau (30/70 : v/v) et la partition entre les diffrents
solvants nous ont permis d'obtenir les phases suivantes :
Phase ther de ptrole : obtenue aprs affrontement par l'ther de ptrole mais elle
est limine car elle ne contient que des matires grasses, des chlorophylles, et des
impurets.
Phase actate d'thyle : obtenue aprs affrontement par l'actate dthyle, ce dernier
qui permet d'extraire les flavonodes, en entrainant les aglycones, les mono-O-
glycosides et partiellement les di -O- glycosides (Benkiki, 2006)
Phase mthyle thyle ctone (MEC) : obtenue aprs affrontement par mthyle
thyle ctone.
Phase eau : c'est la phase rsiduelle. Le mlange des deux phases (phase actate
d'thyle et la phase MEC) sera consacr aux analyses chromatographiques de
sparation (CC et CP).
I-2 / Chromatographie analytique sur couche mince :
Pour avoir les empreintes flavoniques de nos extraits, et avoir une ide sur leurs
compositions chimiques, une chromatographie analytique sur couche mince a t ralise en
utilisant deux systmes solvants moyennement polaires. Sous lumire UV 365 nm Les
diffrentes taches de produits qui se prsentent sur les chromatogrammes ont t dlimites.
Les couleurs des spots et leurs Rf observs sous UV suite une analyse par chromatographie
sur couche mince, nous ont permis de rvler la prsence des flavones et des flavonols.
49
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Tableau XII : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide (DC6) dans le systme
solvant (tolune /mthanol/thanol) (4/3/3)
Thymus vulgaris Rosmarinus officinalis
La phase MEC La phase actate
d'thyle
La phase MEC La phase Actate
d'thyle
Spot color
sous UV 365
nm
Rf Spot color
sous UV 365
nm
Rf Spot color
sous UV 365
nm
Rf Spot color
sous UV 365
nm
Rf
Violet +++ 0.85 Brun marron 0.84 Violet+++ 0.84 / /
Violet 0.62 Violet 0.63 Violet++ 0.6 Brun noir 0.73
Brun 0.49 Brun marron 0.51 Brun 0.5 Violet 0.66
Blanc 0.40 Marron 0.43 Marron clair 0.42 Brun noir 0.54
Violet 0.32 Violet 0.35 Violet+ 0.33 Noir 0.44
Jaune
fluorescent
0.27 Marron jaune 0.25 Jaune
fluorescent
0.28 Violet 0.38
Marron 0.19 Violet 0.12 Marron 0.24 Marron 0.31
Violet 0.14 Jaune ple 0.02 Violet 0.16 Bleu clair 0.14
Marron 0.06 Dpt =jaune
ple
0.0 Violet sombre 0.08 Dpt=jaune
ple
0.0
Dpt=marron
jaune
0.0 / / Marron jaune 0.02 / /
/ / / / Dpt=
marron jaune
0.0 / /
50
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Tableau XIII : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide (DC6) dans le systme
solvant (mthanol/eau/acide actique) (95/5/5)
Thymus vulgaris Rosmarinus officinalis
La phase MEC La phase Actate
d'thyle
La phase MEC La phase Actate
d'thyle
Spot color
sous UV 365
nm
Rf Spot color
sous UV
365 nm
Rf Spot color
sous UV
365 nm
Rf Spot color
sous UV
365 nm
Rf
Violet+++ 0.73 Vert clair 0.71 Violet+++ 0.84 Jaune trs
clair
0.75
Jaune trs clair 0.59 Violet 0.56 Jaune
trs clair
0.75 Gris 0.64
Marron 0.38 Gris 0.51 Violet 0.63 Violet 0.57
Jaune
fluorescent+++
0.28 Violet 0.45 Marron 0.45 Brun noir 0.51
Bleu clair
fluorescent
0.21 Vert jaune 0.34 Jaune+++ 0.32 gris 0.45
Marron+++ 0.13 Bleu clair 0.21 Bleu clair 0.24 Brun noir 0.36
Vert jaune 0.06 Marron 0.11 Marron 0.15 Bleu clair 0.21
Dpt=marron 0.0 Jaune 0.04 Marron+++ 0.06 Marron 0.08
/ / Dpt=jaune
ple
0.0 Dpt
=marron
0.0 Dpt =jaune 0.0
51
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Figure 12 : CCM analytique reprsentative des flavonodes de Thymus vulgaris et de
Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide DC6 dveloppe dans le systme solvant
(tolune/mthanol/thanol) (4/3/3)
52
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Figure 13 : CCM analytique reprsentative des flavonodes de Thymus vulgaris et de
Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide DC6 dveloppe dans le systme solvant
(mthanol/eau/acide actique) (95/5/5)
53
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-3 / Mise en vidence des flavonodes :
La pulvrisation du chromatogramme de gel de silice par une solution thanolique dAlCl
3
(1%)
,
rvle lapparition des taches jaunes, cette coloration est due la formation d'un
complexe entre le chlorure d'aluminium et les atomes d'oxygne prsents sur les carbones des
flavonodes. Ces rsultats affirment lexistence des flavonodes dans les phases exprimant des
taches jaunes.
Figure 14 : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de
Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis sur plaque de silice aprs pulvrisation par
une solution thanolique d'AlCl
3
(1%), dont les taches jaunes correspondent aux flavonodes.
54
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-4 / Dosage des composs phnoliques et des flavonodes :
Le contenu des composs phnoliques a t dtermin par la mthode de Folin ciocalteu. Le
romarin prsente 10,420,003 mg EAT/g dextrait sec de la plante, ces rsultats sont presque
conformes aux travaux de Muchuweti et al (2007), dont ils ont estim 10,83 mg EAG/g pour
lextrait sec du romarin sur lequel ils travaillaient. Le Thymus vulgaris prsente 9,07 0.002
mg EAT/g dextrait sec de la plante.
La quantit des composs phnoliques des extraits thanoliques des plantes tudies
dpend essentiellement : de leur origine (Ebrahimzadeh et al, 2008), la varit, la saison de
culture, la saison de rcolte, les conditions climatiques et environnementales, la localisation
gographique, les diffrentes maladies qui peuvent affecter la plante, la maturit de la plante
(Park et Cha, 2003) et la dure de conservation (zgven et al, 1998)
La teneur en flavonodes des extraits thanoliques en terme de la querctine quivalent
(EQ) est de 8,83 0.026 mg/g EQ pour lextrait sec du romarin, et de 8.56 0.001 mg/g
EQ pour lextrait sec du thym.
Figure 15 : Le contenu des composs phnoliques et contenu des flavonoides dans Thymus
vulgaris et Rosmarinus officinalis.
55
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-5 / Les fractions obtenues par les techniques chromatographiques de
sparation :
I-5-1 / Les flavonodes isols de Thymus vulgaris par CC :
La technique de chromatographie sur colonne de polyamide est utilise pour isoler des
flavonodes du mlange des deux phases actate dthyle et MEC de Thymus vulgaris, dont on
a pu collecter 172 fractions de 25 ml, le contrle de ces fractions sur des plaques de
polyamide nous a permis de slectionner celles qui reprsentent un seul spot bien distingu
sous UV 365 nm .
Tableau XIV : Le mode d'obtention des diffrentes fractions isoles de Thymus vulgaris,
leurs fluorescences sous UV 365nm, leurs Rf sur des plaques de polyamide ou de silice ainsi
que les systmes solvants qui en sont utiliss pour le dveloppement des chromatogrammes.
Molcules Systmes
d'lution
(Tol/MeOH)
pour la CC
Spot color
sous UV 365
nm
Rf Systmes solvants pour le
dveloppement des plaques
01 (50/50) Noir
0.68 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/2.5)
02 (50/50)
Violet 0.63 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/2.5)
03 (50/50) Violet trs clair 0.63 Tol/MeOH/EtOH/Ether de ptrole
(20/15/12.5/2.5)
04 (0/100)
(5/95)
Violet trs clair 0.36 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/1)
05 (90/10) Brun 0.93 Actate d'thyle/MeOH/H
2
O/EP
(20/15/12.5/1.5) (plaque de silice)
06 (65/35)
(70/30)
Bleu violet 0.93 Tol/MeOH/EtOH/EP (20/15/12.5/2.5)
56
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-5-2 / Les flavonodes isols de Rosmarinus officinalis par la CP :
Les flavonodes isols de Rosmarinus officinalis ont t obtenus par la technique de
chromatographie sur papier en utilisant comme luant le systme solvant (acide actique/eau)
(50/50 : v/v). Aprs le dveloppement des chromatogrammes, les bandes correspondant aux
composs sont dlimites sous UV 365 nm.
Tableau XV : Les diffrentes fractions obtenues de Rosmarinus officinalis, leurs
fluorescences sous UV 365nm, ainsi que leurs Rf sur papier Wahtman n3.
Spots Fractions Spot color sous UV
365 nm
Rf
01 A Bleu violet 0.82
02 B violet 0.68
03 C Violet 0.6
57
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-6 / Identification structurale des flavonodes isols :
I-6-1 / Analyse spectrale des flavonodes isols de Thymus vulgaris :
*Molcule 01 :
La fluorescence noire sous UV 365 nm de la molcule 1 et les pics dabsorption dans la
rgion UV-Vis : BI (329,5 nm) et BII (280,5 nm), nous orientent vers la supposition que cette
molcule fait partie des flavonols (3-OH substitu).
Srie I :
Les effets bathochromiques (+46.5nm) de la bande I en prsence de NaOH, et la stabilit
du spectre sont en faveur de la prsence d'un OH libre en C4', l'absence de pic entre 320-
335nm dans le spectre de NaOH par rapport au spectre mthanol indique que le 7-OH est
substitu.
Srie II :
Le faible dplacement hypsochromique (-4nm) de la bande II en prsence de NaOAc
confirme la prsence d'une substitution en C7. La comparaison du spectre NaOAc +H
3
BO
3
par rapport au spectre MeOH nous informe sur l'absence du groupe ortho di OH en C3' C4'.
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
280.5
/
/
329.5
376
376
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc +
H
3
BO
3
280.5
276.5
279
329
337 386
332.5
58
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Srie III :
L'absence du groupe ortho di OH en C3' C4' est confirme suite une comparaison du
spectre AlCl
3
+HCl par rapport au spectre AlCl
3
: faible dplacement hypsochromique (-5.5
nm). L'effet bathochromique du spectre d'AlCl
3
par rapport au spectre mthanol (+22,5nm)
confirme que cette molcule dispose d'un OH libre en C5.
Structure propose : daprs tous les critres cits prcdemment, on propose donc une
schmatisation de la molcule 1 comme suit :
Keampfrol 3OR, 7OR''
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
AlCl
3
AlCl
3
+HCl
281
283
283.5
329
351.5
346
59
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule 02 :
Le spectre mthanol de cette fraction donne deux pics, avec un maximum d'absorption
326 nm pour la bande I et 285.5 nm pour la bande II ainsi que la fluorescence violette de la
molcule 1 sous UV 365 nm nous laissent opter pour un flavone dont le noyau A est
polysubstitu.
Srie I :
L'addition de NaOH se traduit par un effet bathochromique et hyperchromique de la bande
I sans apparition de pic entre 320-335 nm, ces critres indiquent la prsence d'un OH libre en
C4' et une substitution en C7 respectivement.
Srie II :
Le trs faible dplacement hypsochromique (-2nm) que donne le spectre NaOAc affirme la
prsence dune substitution en C7. Le spectre NaOAc+ H
3
BO
3
marque un dplacement de
(+8 nm), cette caractristique est significative la prsence dun groupe ortho di OH en C3
C4 sur le cycle B.
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
285.5
/
/
326
363
/
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc +
H
3
BO
3
285
283
284.5
325
330.5
333
60
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Srie III :
L'tude de la troisime srie spectrale nous mne une confirmation de la prsence d'un
groupe ortho di OH en C3' C4 : un dplacement hypsochromique (-28.5nm) du spectre
dAlCl
3
+HCl, tandis que la comparaison du spectre AlCl
3
/MeOH tmoigne la prsence d'un
OH libre en C5.
Structure propose : tous les critres discuts prcdemment nous mnent proposer la
structure reprsente ci-dessous pour la molcule 2, vu de son Rf lev (0,63) on peut
supposer que le R soit un groupement mthyle.
Lutoline 7OR
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
AlCl
3
AlCl
3
+HCl
285.5
283
286.5
325.5
/ 350
354
61
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule 03 :
Les spectres UV de cette molcule donnent deux pics d'absorption : 321.5 nm (BI) et
281.5 nm (BII), et la fluorescence violette sous UV 365 nm sont en faveur d'un flavone.
Srie I :
Le dplacement bathochromique (+53.5nm) et hyperchromique de la bande I suite
l'addition de NaOH, et l'apparition de pic entre (320-335) nm indiquent respectivement la
prsence d'un OH libre en C4' et un autre en C7.
Srie II :
La comparaison du spectre NaOAc + H
3
BO
3
par rapport au spectre MeOH rsulte d'un
effet bathochromique (+16nm) ce qui nous informe sur la prsence d'un groupe ortho di OH
en C3'C4'.
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs 5
min)
287.5
280
280
321.5
375 323.5
323.5
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc +
H
3
BO
3
287
284
287.5
321.5
326.5
337.5
62
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Srie III :
Les comparaisons suivantes : AlCl
3
+HCl/AlCl
3
et AlCl
3
/ MeOH rsultent respectivement
dun effet hypsochromique (-50nm) et bathochromique (+41nm) de la bande I ce qui nous
informent sur la prsence d'un groupe ortho dihydroxy en C3' C4' et sur la prsence d'un OH
libre en C5.
Structure propose : daprs les informations obtenues, on peut proposer la structure
suivante pour la molcule 3 isole de Thymus vulgaris.
Lutoline
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
AlCl
3
AlCl
3
+HCl
287.5
288
288
321.5
362.5
314.5
312.5
63
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule 04 :
Le spectre mthanolique de la molcule 4 donne deux pics, avec un maximum d'absorption
de 332 nm pour la bande I et 283 nm pour la bande II, ce qui nous laisse opter pour un
flavonol avec un (3OH substitu). (Les spectres sont reprsents dans lannexe)
Srie I :
L'addition de NaOH provoque un dplacement bathochromique de (+48 nm) et
hyperchromique traduisant la prsence d'un OH libre en C4', l'absence de pic entre (320-335)
nm indique la prsence d'une substitution en C7.
Srie II :
L'absence de 7OH libre est confirme suite l'addition de NaOAc qui ne provoque qu'un
trs faible dplacement hypsochromique de la bande II (-0.5nm). L'ajout de H
3
BO
3
conduit
un dplacement bathochromique de (+15nm) indiquant la prsence d'un groupe ortho di OH
en C3'C4'.
Srie III :
L'effet bathochromique rsulte dune comparaison du spectre d'AlCl
3
par rapport au spectre
mthanol de la bande I (+31nm) indique que la molcule dispose d'un OH libre en C5.
Finalement, l'effet hypsochrome (-30nm) en prsence d'HCl (AlCl
3
+ HCl/ AlCl3) nous
confirme la prsence du groupement ortho di OH en C3' C4'.
Structure propose : Vu que le Rf est de 0.36 dans le systme solvant
(tolune/mthanol/thanol /ther de ptrole) (20/15/12,5/1), il est fort possible qu'on ait un
sucre en C 3 ou en C 7 sinon les deux. Car la glycosylation fait diminuer les valeurs des Rf.
Querctine 3OR ', 7OR''
64
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule 05 :
Srie I :
La comparaison du spectre NaOH par rapport au spectre MeOH ne montre qu'un trs faible
dplacement bathochromique de la bande I (+2.5 nm) ce qui traduit l'absence d'un OH en C4'.
Srie II :
La comparaison du spectre NaOAc par rapport au spectre MeOH : pas d'effet ce qui
traduit la prsence d'une substitution en C7. NaOAc + H
3
BO
3
/ MeOH ne donne aucun effet,
cela peut tre due l'absence du groupe ortho di OH en C3' C4'.
Srie III :
Laddition dAlCl
3
rsulte d'un effet bathochromique (+39nm), et une comparaison entre
AlCl
3
+HCl/MeOH donne un dplacement bathochromique important de (+35nm), ces
critres indiquent que la molcule dispose d'un OH libre en C5. La comparaison des
spectres AlCl
3
+HCl /AlCl
3
rsulte d'un faible dplacement hypsochromique (-4nm), ce qui
affirme l'absence du groupe ortho di OH en C3' C4'. Vu que le Rf est de 0.93 dans le systme
apolaire (tolune/thanol/mthanol /ther de ptrole) (20/15/12,5/1,5), on suppose que cette
molcule est polaire, son R peut tre un groupement mthyle.
Structure propose :
Chrysine 7OR
65
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule 06 :
Le spectre mthanolique donne un maximum d'absorption 323.5nm pour la bande I et
282 nm pour la bande II, et la fluorescence violette de la molcule 6 sous UV 365nm nous
laissent opter pour un flavone. Vu de son Rf lev (0.93) dans le systme solvant apolaire
(tolune/thanol/mthanol /ther de ptrole) (20/15/12,5/2,5), donc il est fort possible qu'au
moins l'un de R' ou R'' est un groupement mthyle sinon les deux.
Srie I :
Un dplacement bathochromique (+41.5nm) et hyperchromique sont observs suite une
comparaison du spectre de NaOH par rapport au spectre MeOH, ce qui tmoigne la prsence
d'un OH libre en C4'. L'absence de pic entre (320-335) nm indique la prsence d'une
substitution en C7.
Srie II :
Le faible dplacement hypsochromique de la bande II (-1nm) en prsence de NaOAc nous
confirme la prsence d'une substitution en C7, puis l'ajout de H
3
BO
3
ne provoque qu'un trs
faible dplacement bathochromique (+0.5) de la bande I ce qui tmoigne l'absence du groupe
ortho di OH en C3' C4'.
Srie III :
Le faible dplacement hypsochromique de la bande I (AlCl
3
+HCl/AlCl
3
)
confirme
l'absence de groupe ortho di OH en C3' et C4'. On suppose aussi que cette molcule ne
dispose pas d'un OH libre en C5 car l'addition d'AlCl
3
ne provoque qu'un faible dplacement
de (+0.5) nm par rapport au spectre mthanol.
Structure propose :
Apignine 5OR, 7OR''
66
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
I-6-2 /Analyse spectrale des flavonodes isols de Rosmarinus officinalis :
*Molcule A :
Le maximum dabsorption de la bande I se situe 330.5 nm, celui de la bande II est 290
nm, et la fluorescence bleue violette sont en faveur d'un flavonol (3OR) au noyau
polysubstitu.
Srie I :
L'effet bathochromique (+45nm) combin l'effet hyperchromique de la bande I aprs
addition de NaOH nous informent sur la prsence d'un 4'OH.
Srie II :
Le NaOAc, une fois ajout, provoque un dplacement bathochromique important de la
bande II cela veut dire que notre molcule dispose d'un OH libre en C7, l'addition de H
3
BO
3
rsulte d'un effet bathochromique de (+16,5 nm) de la bande I indiquant la prsence d'un
groupement ortho di OH en C3' C4'.
Srie III :
Le dplacement bathochromique (+33.5nm) suite l'addition d'AlCl
3
indique que la
molcule est un flavonol avec un OH libre en C5. La comparaison (AlCl
3
+HCl/AlCl
3
) rsulte
dun dplacement hypsochromique de (-28nm) ce qui affirme la prsence d'un groupe ortho
di OH en C3C4.
Structure propose :
Querctine 3OR'
67
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule B :
Le spectre mthanolique nous donne deux maximums dabsorption lun correspond la
bande I (345 nm) et lautre est celui de la bande II (271 nm), ces caractristiques sont en
faveur de la prsence dun flavonol au noyau A polysubstitu.
Srie I :
L'addition de NaOH donne un effet bathochromique (+54nm) et hyperchromique de la
bande I, avec apparition de pic entre 320-335 nm, signifiant la prsence d'un OH libre en C4',
et un autre OH libre en C7 respectivement.
Srie II :
L'addition de NaOAc provoque un effet bathochromique (+18nm) de la bande II cela
confirme la prsence d'OH libre en C7, puis l'ajout du H
3
BO
3
donne un dplacement
bathochromique (+21.5nm) traduisant la prsence d'un groupe ortho di OH en 3' et 4'.
Srie III :
L'addition d'AlCl
3
provoque un dplacement bathochromique trs important (+69nm) de la
bande I par comparaison au spectre mthanol ce qui nous permet de dduire que cette
molcule dispose d'un OH libre en C3. La prsence d'un OH libre en C5 est confirme par le
dplacement bathochromique (+19.5nm) de la bande I suite l'addition d'HCl. La
comparaison du spectre AlCl
3
+HCl par rapport au spectre AlCl
3
nous confirme l'existence
du groupe 3',4' ortho di OH sur le cycle B, car cette comparaison marque un dplacement
hypsochromique important (-49.5nm).
Structure propose :
Querctine
68
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
*Molcule C :
La fluorescence violette sous UV, ainsi que les maximums d'absorption des deux bandes
respectivement 338.5nm (BI) et 272 nm (BII) sont en faveur de la prsence dun flavone.
Srie I :
Le dplacement bathochromique de la bande I (+48nm) provoqu suite l'addition de
NaOH traduit l'existence d'un OH libre en C4.
Srie II :
L'absence de tout dplacement de la bande II suite l'addition de NaOAc indique la
prsence d'une substitution en C7, puis l'ajout d' H
3
BO
3
conduit un dplacement de (+10
nm) ce qui signifie la prsence d'un groupe ortho di-OH en C3' et C4'.
Srie III :
Laddition dAlCl
3
rsulte d'un dplacement bathochromique de (+48.5nm), et une
comparaison du spectre AlCl
3
+HCl par rapport au spectre MeOH rsulte dun dplacement
bathochromique quivalent (+22nm), ces informations nous laissent opter pour une
molcule qui dispose d'un OH libre en C5. La comparaison du spectre AlCl
3
+HCl par rapport
au spectre AlCl
3
rsulte d'un dplacement hypsochromique (-26.5nm), ceci nous juge
l'existence dun groupe di OH en C3' et C4'.
Structure propose :
Lutoline 7 OR
69
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
Tableau XVI : Tableau rcapitulatif reprsentant les structures des diffrents flavonodes
isols de Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis respectivement.
Molcules Structures Dnominations
01
Keampfrol 3OR'
7OR''
02
Lutoline 7 OR
03
Lutoline
04
Querctine 3OR
7OR
05
Chrysine 7OR
06
Apignine 5OR
7 OR
A
Querctine 3 OR
O
C
II
O OH
OH
OR'
OR''
O
C
II
O
OH
OR'
OH
OH
OH
O
C
II
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OR'
O
C
II
O
OR''
O
C
II
O
OH
OR'
O
C
II
O
OH
OR'
OR''
OH
OH
OH
O
C
II
O
OH
OR'
R''
R'''
70
Rsultats et discussion ChapitreI Etude phytochimique
B
Querctine
C
Lutoline 7OR
O
OH
OH
OH
OH
OH
C
II
O
OH
OH
O
C
II
O
OH
OR
71
Chapitre II
Etude des activits biologiques
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
II-1 / Evaluation du pouvoir antiradicalaire des flavonodes isols de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis :
L'activit antiradicalaire de nos produits a t value par la mthode de DPPH. Une
solution mthanolique de DPPH (2-2-diphnyl-1-picrylhydrazyl) prsente une coloration
violette sombre, en prsence d'un antioxydant, la forme rduite de DPPH-H confre la
solution une coloration jaune, et par consquent une diminution de l'absorbance (Perez et al,
2007)
Figure 16 : Pigeage de DPPH par les flavonodes (ph : noyau phnolique) (Ami et al,
2003)
Le changement de la couleur de la solution mthanolique de DPPH en prsence de chacun
des produits flavoniques tester a t mesur 517 nm, les rsultats figurant dans les
tableaux et les figures ci-aprs illustrent les pourcentages de l'activit antiradicalaire des
principaux flavonodes isols respectivement de Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis
vis--vis du radical libre DPPH.
NO2
NO2
O2N
N
..
.
N
Ph
Ph
+
ROH
O2N
NO2
NO2
N
H
..
N
:
Ph
Ph
+ RO
.
DPPH ( Violet )
Flavonoide
DPPHH ( Jaune )Flavonoide radical
phnoxyle
72
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
Tableau XVII: Pourcentages de l'activit antiradicalaire de la querctine standard et des
principaux flavonodes isols de Thymus vulgaris (Kaempfrol 3OR 7OR ; Lutoline
7OR ; Lutoline; Querctine 3OR 7OR ; Chrysine 7OR ; Apignine 5OR 7OR) vis--
vis du radical libre DPPH.
Molcules Querctine
standard
Molcule
1
Kaempfrol
3OR
7OR
Molcule
2
Lutoline
7OR
Molcule
3
Lutoline
Molcule
4
Querctine
3 OR
7OR
Molcule
5
Chrysine
7OR
Molcule
6
Apignine
5OR
7OR
% de l'activit
antiradicalaire
vis--vis du
DPPH
93.05%
50.17%
52.58%
58.30%
70.45%
5.66%
50.96%
Figure 17 : Pourcentages de l'activit antiradicalaire des principaux flavonodes isols de
Thymus vulgaris classs selon l'ordre dcroissant suivant : Querectine standard (93.05%) >
Querctine 3 OR 7 OR (70.45%) > Lutoline (58.30%) > Lutoline 7OR (52.58%) >
Kempfrol 3OR' 7OR'' (50.17%) > Apignine 5 OR 7OR (50.96%) > Chrysine 7OR
(5.66%)
73
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
Tableau XVIII: Pourcentages de l'activit antiradicalaire de la querctine standard et des
principaux flavonodes isols de Rosmarinus officinalis (Querctine 3OR ; Querctine ;
Lutoline 7OR) vis--vis du radical libre DPPH
Molcules Querctine
standard
Molcule A
Querctine
3OR
Molcule B
Querctine
Molcule C
Lutoline
7OR
% de l'activit
antiradicalaire
vis--vis du
DPPH
93.05%
90.05%
88.18%
87.07%
Figure 18 : Pourcentages de l'activit antiradicalaire des principaux flavonodes isols de
Rosmarinus officinalis classs selon l'ordre dcroissant suivant : Querctine standard
(93.05%) > Querctine 3OR' (90.05%) > Querctine (88.18%) > Lutoline 7OR (87.07%)
74
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
De nombreuses tudes ont tabli la relation entre la structure et l'activit antiradicalaire des
flavonodes (Chen et al, 1996 ; Rice Evens et al, 1996 ; Sofic et al, 1997; Lien et al, 1999)
in (Ami et al, 2003) cette activit ncessite trois critres :
La structure ortho-dihydroxy sur le cycle B
La double liaison C2-C3 en conjugaison avec la fonction 4-oxo
La prsence du groupement OH en position 3 et 5 en combinaison avec la double
liaison C2-C3 qui donne une activit antiradicalaire maximale
La querctine satisfait tous ces critres, dont la querctine (3OR, 7OR) isole du thym,
ainsi que celles isoles du romarin (querctine et querctine 3OR) possdent une trs bonne
activit antiradicalaire contre le radical libre DPPH dont elles prsentent un pourcentage de
rduction de 70,45% ; 90,05% ; 88,18% respectivement. Certains auteurs supposaient que la
capacit de la querctine piger les radicaux libres est en relation directe avec la prsence
d'une structure O-dihydroxybenzne qui est considre comme un caractre essentiel pour
avoir une activit antioxydante importante (Bors Heller et al, 1990) in (Es Safi et al, 2007)
La prsence d'un OH libre en C3 amliore normment cette activit dont de nombreux
auteurs annonaient que le groupe 3OH est le facteur le plus important qui confre aux
flavonodes une activit antioxydante significative (Van Acker et al, 1996 ; Arora et al,
1998 ; Heijnen et al, 2001) in (Ami et al, 2003). Mais nos rsultats ont montr le contraire
dont l'activit de rduction de la querctine 3OR (90.05%) est suprieure a celle de
querctine avec 3OH libre (88,18%) cela peut tre expliqu par le fait que le noyau A de la
(querctine 3 OR) est polysubstitu, et il est fort possible que ces substitutions soient des
OH libres en C6 et en C8 formant des structures ortho dihydroxy sur le noyau A, ce qui
amliore cette activit antiradicalaire (Rice Evans et al, 1993)
La lutoline reprsente galement une bonne activit de pigeage contre le radical libre
DPPH car elle rpond certains des critres essentiels pour avoir une activit antiradicalaire
efficace ; la prsence de groupe 3',4' ortho di-OH sur le noyau B, la prsence de la double
75
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
liaison C2= C3 en conjugaison avec le groupe 4 oxo, et la prsence dun OH libre au niveau
du carbone C5 (Oszmiaski et Czemerys, 2007)
Les rsultats obtenus montrent que la Lutoline (7OR) du thym reprsente une activit
antiradicalaire quivalente (52.58%) tandis que celle avec (7OH) donne plus d'activit
(58.30%) cela peut tre due l'existence d'un autre OH libre en C7 qui vise amliorer
l'activit de pigeage du radical libre DPPH car plus quil y a dOH libre plus lactivit
antioxydante est importante (Sofic et al, 1997) in (Es Safi et al, 2007)
Les rsultats quAmi et al (2002) trouvaient pour le pourcentage de rduction de DPPH
par la lutoline commercialise (87.6%) ressemblent ceux quon a obtenu dont la lutoline
7OR du romarin a donn un pourcentage de rduction quivalent (87,07%).
Les valeurs de lactivit de pigeage du kaempfrol (3OR, 7OR) (50.17%) et
d'apignine (5 OR, 7OR) (50.96%) isols du thym sont presque quivalentes, malgr quils
appartiennent deux classes diffrentes de flavonodes (kaempfrol est un flavonol tandis
que lapignine est un flavone) cela peut tre expliqu par le fait que lOH en C3 du
kaempfrol est substitu et il est fort possible que cette substitution soit un glycoside. Selon
Plumb De Pascual Teresa et al (1998) in (Es Safi et al, 2007; Oszmiaski et Czemeryz,
2007) les aglycones ont plus dactivit par comparaison aux flavonodes glycosyls.
Daprs les travaux d Ami et al (2003), les rsultats montraient que l'apignine 7-gly
(commercialise) ne reprsente que (34.8%) d'activit de pigeage alors que lapignine
(7OR) isol de notre Thymus vulgaris donne plus d'activit (50.96%), donc on peut
supposer que la substitution au niveau du carbone C7 soit un groupement mthyle car Rice
Evans et al (1995) et Cosio et al (2006) suggrent que les groupements mthyles augmentent
la stabilit du radical libre et amliorent l'activit antiradicalaire des flavonodes.
76
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
II-2 / Rsultats de l'activit antibactrienne des flavonodes isols de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis :
Nous avons tudi in vitro le pouvoir antibactrien des flavonodes isols de Thymus
vulgaris et de Rosmarinus officinalis par la mthode de diffusion des disques sur un milieu
glos solide (Muller Hinton).
Lactivit antibactrienne de nos produits est estime en terme de diamtre de la zone
d'inhibition autour des disques contenant les produits flavoniques tester vis--vis de trois
germes pathognes d'origine hospitalire (Escherichia coli, Staphylocaccus aureus,
Enterobacter spp) aprs 24 heurs d'incubation une temprature adquate de 37c.
Les rsultats des diamtres des zones dinhibition rvlent quEscherichia coli apparait
sensible vis--vis des flavonodes tests, ces mmes flavonodes dveloppent des zones
dinhibition moyennement importantes vis--vis de Staphylococcus aureus dont les diamtres
des zones dinhibition varient entre (8-18) mm pour Escherichia coli (figures 19 et 20), et de
(10-15) mm pour Staphylococcus aureus (figures 21 et 22)
La sensibilit dEscherichia coli et de Staphylococcus aureus traduit laction
antibactrienne des flavonodes. En fait, cette sensibilit est en relation avec le nombre des
hydroxyles libres dont on constate que les flavonodes les moins hydroxyls sont les plus
actifs, titre d'exemple le flavonode n5 (qui possde uniquement un seul OH libre au
niveau du carbone 5) de Thymus vulgaris dveloppe des zones d'inhibition quivalentes 15
mm pour Staphylococcus aureus et 18 mm pour Escherichia coli.
Cowan (1999) supposait que les flavonodes dpourvus des groupements hydroxyles libres
ont plus d'activit antimicrobienne par rapport ceux qui en sont pourvus, ce qui conduit
une augmentation de leur affinit chimique aux lipides membranaires, donc on peut supposer
que la cible microbienne de ces flavonodes tests est la membrane cytoplasmique.
77
Rsultats et discussion C
Figure 19 : Diamtres des zones dinhibition (mm)
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis
dcroissant suivant : molcule 5 (1seul OH libre)
(2OH libres) molcule 2 (3OH libres) = molcule 4 (3OH libres)
libres) = molcule C (3OH libres)
Figure 20 : Photos reprsentatives d
flavonodes tests.
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
Diamtres des zones dinhibition (mm) des principaux flavonodes
Rosmarinus officinalis vis--vis dEscherichia coli, classs selon l'ordre
molcule 5 (1seul OH libre) molcule 6 (2OH libres)
molcule 2 (3OH libres) = molcule 4 (3OH libres)
= molcule C (3OH libres) molcule B (5OH libres) molcule 3 (4OH libres)
Photos reprsentatives des zones d'inhibition (mm) d'Escerichia
Etude des activits biologiques
flavonodes isols de
classs selon l'ordre
molcule 6 (2OH libres) molcule 1
molcule A (4OH
molcule 3 (4OH libres)
Escerichia coli par les
78
Rsultats et discussion
Figure 21 : Diamtres des zones dinhibition (mm)
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis
l'ordre dcroissant suivant :
molcule 1 (2OH libres) molcule 4 (3OH libres)
(3OH libres) molcule 3(4OH libres) = molcule A (4OH libres) =
libres)
molcule A (4OH libres), molcule B (5OH libres)
Figure 22 : Photos reprsentatives d
les flavonodes tests.
ChapitreII Etude des activits biologiques
Diamtres des zones dinhibition (mm) des principaux flavonodes
Rosmarinus officinalis vis--vis de Staphylococcus aureus
molcule 5 (1seul OH libre) = molcule 6 (2OH libres)
molcule 4 (3OH libres) molcule 2 (3OH libres)
molcule 3(4OH libres) = molcule A (4OH libres) =
molcule A (4OH libres), molcule B (5OH libres)
Photos reprsentatives des zones d'inhibition (mm) de Staphylococcus aureus
Etude des activits biologiques
flavonodes isols de
Staphylococcus aureus, classs selon
molcule 5 (1seul OH libre) = molcule 6 (2OH libres)
molcule 2 (3OH libres) = molcule C
molcule B (5OH
Staphylococcus aureus par
80
Rsultats et discussion
Les rsultats obtenus (figures 2
romarin dveloppent des zones d'inhibition faibles vis
insensibilit est explique par le fait que cette bactrie est reconnue par sa rsistance aux
agents antibactriens (Strang, 2006)
Figure 23 : Diamtres des zones dinhibition (mm)
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis
Figure 24 : Photos reprsentatives d
du romarin vis--vis d'Enterobacter
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
Les rsultats obtenus (figures 23 et 24) indiquent que les flavonodes du thym et du
romarin dveloppent des zones d'inhibition faibles vis--vis dEnterobacter spp
est explique par le fait que cette bactrie est reconnue par sa rsistance aux
agents antibactriens (Strang, 2006)
Diamtres des zones dinhibition (mm) des principaux flavonodes
Rosmarinus officinalis vis--vis dEnterobacter spp
Photos reprsentatives des zones d'inhibition (mm) des flavonodes du thym et
Enterobacter spp.
Etude des activits biologiques
) indiquent que les flavonodes du thym et du
Enterobacter spp. Cette
est explique par le fait que cette bactrie est reconnue par sa rsistance aux
flavonodes isols de
zones d'inhibition (mm) des flavonodes du thym et
79
81
Rsultats et discussion ChapitreII Etude des activits biologiques
Il en ressort de cette analyse que chaque compos agit diffremment sur les
microorganismes. C'est--dire, quun compos peut avoir une action trs importante sur un
germe (la sensibilit dEscherichia coli et de Staphylococcus aureus aux flavonodes tests)
ou une action moindre, voire mme nulle sur un autre (la rsistance dEnterobacter spp)
L'activit antibactrienne des flavonodes peut tre explique par le mcanisme de toxicit
vis--vis des microorganismes qui se fait soit par des interactions non spcifiques telles que
l'tablissement des ponts hydrognes avec les protines des parois cellulaires ou les enzymes,
la chlation des ions mtalliques, inhibition du mtabolisme bactrien, la squestration de
substances ncessaires la croissance des bactries (Karou et al, 2005)
Conclusion
Conclusion
Conclusion :
Les plantes mdicinales restent toujours la source fiable des principes actifs connus par
leurs proprits thrapeutiques. Une tude des proprits antioxydante et antibactrienne a
concern deux plantes, appartiennent la famille des labies trs frquemment employes en
Algrie.
Les analyses qualitatives effectues par la chromatographie sur couche mince de gel de
polyamide et de silice, ont montr sous UV la prsence dune multitude de varits de
composs phnoliques. Quantitativement, lvaluation du contenu des phnols totaux en
adoptant la mthode de Folin ciocalteu rvle la prsence des quantits moyennement
importantes en polyphnols. De mme nous avons dos les flavonodes par la mthode
dAlCl
3
qui nous mne conclure que ces deux plantes contiennent principalement des
flavonodes, ces derniers sont par la suite isols par des diffrentes techniques
chromatographiques de sparation dont leur structure a t lucide par une tude directe au
spectrophotomtre UV-Vis. Il ressort de ces analyses que les deux plantes Thymus vulgaris et
Rosmarinus officinalis sont riches en flavonodes de types flavones et flavonols.
Le potentiel antiradicalaire des flavonodes isols a t dtermin par la mthode de
DPPH dont les rsultats montrent que ces flavonodes possdent une bonne activit, donc ces
molcules sont considres comme des agents antioxydants de premire classe et peuvent tre
employes pour des applications thrapeutiques, sachant que les antioxydants contribuent de
manire trs efficace la prvention des maladies telles que le cancer, et les maladies
cardiovasculaires. Au cours de cette tude nous avons ralis galement un test antibactrien
vis--vis de quelques germes pathognes, les rsultats microbiologiques ont montr que les
flavonodes du thym et du romarin agissent diffremment sur les espces bactriennes
testes.
Sachant que notre pays possde une biodiversit immense dont chaque plante se
caractrise par un rservoir assez important de mtabolites secondaires avec des
caractristiques thrapeutiques et pharmacologiques particulires qui demandent dtre
exploites par les recherches, de cet effet, et comme perspectives on propose de :
82
Conclusion
Dterminer de nouvelles substances bioactives naturelles pourront rpondre
aux diffrents problmes de la sant et dtre un alternatif des mdicaments
synthtiques.
Dvelopper des mdicaments antiradicalaires base des plantes, dous dune
activit antioxydante.
Orienter les recherches scientifiques vers la ralisation des tudes approfondies
et complmentaires de lactivit antioxydante et antibactrienne des composs
polyphnoliques en gnral et des flavonodes en particulier.
83
Rfrences bibliographique
Rfrences bibliographique
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Annexes
Annexes
Annexes
Annexes
Spectre UV-Vis de la molcule 4 de Thymus vulgaris
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
283
/
/
332
380
382.5
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc
+H3BO3
282
281.5
281.5
332.5
329
347.5
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
Alcl 3
Alcl3 +Hcl
283
275.5
283
333
364
334
Annexes
Spectres UV-Vis de la molcule 5 de Thymus vulgaris
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
283
280.5
281.5
322.5
325
/
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc
+H3BO3
282.5
283.5
286.5
322
322.5
322
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
Alcl 3
Alcl3 +Hcl
282
301.5
291.5
322.5
361.5
357.5
301
Annexes
Spectre UV-Vis de la molcule 6 de Thymus vulgaris
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
282
/
/
323.5
365
369
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc
+H3BO3
282
281
280.5
323.5
322.5
324
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
Alcl 3
Alcl3 +Hcl
282
280.5
281.5
324
324.5
322.5
Annexes
Spectres UV-Vis de la molcule A de Rosmarinus officinalis
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
290
/
/
330.5
375.5
375.5
Solvants
utiliss
BII (nm) BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc
+H3BO3
290
289+epau
292.5
331
335
347.5
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
Alcl 3
Alcl3 +Hcl
290
263.5
291.5
330
363
299
335.5
301
Annexes
Spectres UV-Vis de la molcule B de Rosmarinus officinalis
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
271
266.5
267.5
345
399
400.5
Solvants
utiliss
BII (nm) BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc
+H3BO3
271
Epau 289
271
261
343
383
325
364.5
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
Alcl 3
Alcl3 +Hcl
271
273.5
257.5
345
414
280.5
364.5
Annexes
Spectres UV-Vis de la molcule C de Rosmarinus officinalis
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
+NaOH
NaOH (aprs
5 min)
272
270
270
338.5
387
387.5
Solvants
utiliss
BII (nm) BI (nm)
MeOH
NaOAc
NaOAc
+H3BO3
272
270
270
338.5
387
348.5
Solvants
utiliss
BII
(nm)
BI (nm)
MeOH
Alcl 3
Alcl3 +Hcl
272.5
257
295.5
338.5
387
360.5
Liste des figures
Figure 1 : Photo de Thymus vulgaris.
Figure 2: Photo de Rosmarinus officinalis.
Figure 3 : La voie de shikimate.
Figure 4: La voie de phnylpropanoide.
Figure 5: La voie de biosynthse des flavonodes.
Figure 6 : Pigeage des espces ractives drives de loxygne (R) par les flavonodes
et la formation d'une structure stable
Figure 7 : Critres structuraux essentiels pour avoir une bonne activit antioxydante des
flavonodes..
Figure 8 : Principaux sites impliqus dans la chlation des ions mtalliques
(Me+)...
Figure 9 : Principaux compartiments impliqus dans le mtabolisme des
flavonodes
Figure 10 : Protocole d'extraction des flavonodes.
Figure 11: Protocole d'tude spectrale des flavonodes en prsence des diffrents
ractifs .
Figure 12 : CCM analytique reprsentative des flavonodes de Thymus vulgaris et de
Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide DC6 dveloppe dans le systme
solvant (tolune/mthanol/thanol) (4/3/3).
Figure 13 : CCM analytique reprsentative des flavonodes de Thymus vulgaris et de
Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide DC6 dveloppe dans le systme
solvant (mthanol/eau/acide actique) (95/5/5)..
Figure 14 : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et MEC de
Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis sur plaque de silice aprs pulvrisation
par une solution thanolique d'AlCl
3
(1%), dont les taches jaunes correspondent aux
flavonodes.
5
8
12
13
14
22
23
24
31
34
44
52
53
54
Liste des figures Liste des figures Liste des figures Liste des figures
Figure 15 : Le contenu des composs phnoliques et contenu des flavonodes dans les
deux plantes tudies
Figure 16 : Pigeage de DPPH par les flavonodes
Figure 17 : Pourcentages de l'activit antiradicalaire des principaux flavonodes isols
de Thymus vulgaris.
Figure 18 : Pourcentages de l'activit antiradicalaire des principaux flavonodes isols
de Rosmarinus officinalis..
Figure 19 : Diamtres des zones dinhibition (mm) des principaux flavonodes isols de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis vis--vis dEscherichia
coli.
Figure 20 : Photos reprsentatives des zones d'inhibition (mm) d'Escerichia coli par les
flavonodes tests..
Figure 21 : Diamtres des zones dinhibition (mm) des principaux flavonodes isols de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis vis--vis de Staphylococcus
aureus..
Figure 22 : Photos reprsentatives des zones d'inhibition (mm) de Staphylococcus
aureus par les flavonodes tests.
Figure 23 : Diamtres des zones dinhibition (mm) des principaux flavonodes isols de
Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis vis--vis dEnterobacter
spp.
Figure 24 : Photos reprsentatives des zones d'inhibition (mm) des flavonodes du
thym et du romarin vis--vis d'Enterobacter spp
55
72
73
74
78
78
79
79
80
80
Liste des tableaux
Tableau I: Principaux acides hydroxybenzoiques.
Tableau II: Principaux acides hydroxycinnamiques..
Tableau III: Principaux types de coumarines.
Tableau IV : Principales classes des flavonodes..
Tableau V : Distribution alimentaire des principales classes de flavonodes .
Tableau VI : Les diffrents systmes solvants utiliss pour la CCM de gel de
polyamide
Tableau VII : Les diffrents systmes solvants utiliss pour la CCM de gel de
silice..
Tableau VIII : La relation entre le Rf et la structure des flavonodes.
Tableau IX : La relation entre la fluorescence et la structure des flavonodes.
Tableau X : Principales caractristiques des spectres UV-Visible des
flavonodes...
Tableau XI : Principales caractristiques spectrales UV-Visible des flavonodes
en prsence des diffrents ractifs
Tableau XII : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et
MEC de Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide
(DC6) dans le systme solvant (tolune /mthnol/thanol) (4/3/3)..
Tableau XIII : Comportement chromatographique des phases actate d'thyle et
MEC de Thymus vulgaris et Rosmarinus officinalis sur plaque de polyamide
(DC6) dans le systme solvant (mthanol/eau/acide actique) (95/5/5).
Tableau XIV : Le mode d'obtention des diffrentes fractions isoles de Thymus
vulgaris, leurs fluorescences sous UV 365nm, leurs Rf sur des plaques de
polyamide ou de silice ainsi que les systmes solvants qui en sont utiliss pour le
dveloppement des chromatogrammes
15
16
16
18
20
35
36
37
38
43
45
50
51
56
Liste des Liste des Liste des Liste des tableaux tableaux tableaux tableaux
Tableau XV : Les diffrentes fractions obtenues de Rosmarinus officinalis, leurs
fluorescences sous UV 365nm, ainsi que leurs Rf sur papier
Wathman3
Tableau XVI : Tableau rcapitulatif reprsentant les structures des diffrents
flavonodes isols de Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis
respectivement.
Tableau XVII: Pourcentages de l'activit antiradicalaire de la querctine
standard et des principaux flavonodes isols de Thymus vulgaris
Tableau XVIII: Pourcentages de l'activit antiradicalaire de la querctine
standard et des principaux flavonodes isols de Rosmarinus officinalis
57
70
73
74
=--- :
--' (Thymus vulgaris) .,'` (Rosmarinus officinalis) --' --- '-'--- ',,--' '-'= -
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0.026 + 8.83 _'- / EQ ---''- .,'` ---' . ='' -= '-- --,- --' - -==-- -' -,-,`-' - ='
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querctine 7OR'), ( , apignine (5OR' 7OR''), lutoline kaempfrol (3OR' 7OR'') chrysine
(7OR'), - --`' '-- '='-- -== -- .,'` --- -,-,` '- - 90% 88% 87% _- ',-' _'=
,querctine (3OR') querctine .lutoline,
'--` - _'= =--' ,=,',,-,-' _-'--' -'=- -'-=- ,-'-=- -,=--- ,=` -- --,- ,,--'
--' -- .=- --' -' -,-,`-' .
'---- '---- : Thymus vulgaris , Rosmarinus officinalis, -,-,`-' --`' '--' '--'
',,--''
Summary:
The thyme (Thymus vulgaris) and rosmary (Rosmarins officinalis) are labiatae used since
the antiquity in traditional medicine, recognized by their therapeutic virtues. In this context,
the present work concerns a phytochemistry study of the majority of flavonoids cantained in
these plants, and an evaluation of their antioxidant and antibacterial activities.
The content of flavonoids in the ethanolic extracts is : 8, 560,001 mg/g QE for thyme and
8, 830,026 mg/g QE for rosmary. The flavonoids isolated from Thymus vulgaris present an
activity of trapping of the free radical DPPH in the order of 70%, 58%, 52%, 51%, 50%, 5%
respectively for quercetin (3OR, 7OR), luteolin, luteolin (7OR), apigenin (5OR, 7OR),
kaempferol (3OR, 7OR), and chrysin (7OR), whereas those isolated from Rosmarinus
officinalis, are characterized by an activity of 90%, 88%, 87% respectively for quercetin
(3OR), quercetin, luteolin (7OR). The microbiological results showed that the flavonoids
isolated act differently on the bacterial species tested.
Key words: Thymus vulgaris, Rosmarins officinalis, flavonoids, antioxidant, antibacterial.
Zeghad Nadia Soutenu le : 16/12/2009
Etude du contenu polyphnolique de deux plantes mdicinales dintrt conomique
(Thymus vulgaris, Rosmarinus officinalis) et valuation de leur activit antibactrienne.
Resum :
Le thym (Thymus vulgaris) et le romarin (Rosmarinus officinalis) sont des labies utilises
depuis l'antiquit en mdecine traditionnelle reconnues par leurs vertus thrapeutiques. Dans ce
contexte, le prsent travail porte sur une tude phytochimique des flavonodes majoritaires
contenus dans ces plantes, et une valuation de leurs activits antioxydante et antibactrienne.
La teneur en flavonodes des extraits thanoliques est de : 8.560.001 mg /g EQ pour le thym
et de 8,83 0.026 mg/g EQ pour le romarin. Les flavonodes isols de Thymus vulgaris
prsentent une activit de pigeage du radical libre DPPH de l'ordre de 70%, 58 %, 52 %, 51%,
50% et 5% respectivement pour querctine (3OR, 7OR), lutoline, lutoline (7OR),
apignine (5OR, 7OR), kaempfrol (3OR, 7OR), chrysine (7OR) tandis que ceux isols de
Rosmarinus officinalis sont caractriss par une activit antiradicalaire de 90%, 88%, 87%
respectivement pour querctine (3OR), querctine, lutoline (7OR). Les rsultats
microbiologiques ont montr que les flavonodes du thym et du romarin agissent diffremment
sur les espces bactriennes testes.
Mots cls : Thymus vulgaris, Rosmarinus officinalis, flavonodes, antioxydante, antibactrienne.
Laboratoire de dveloppement et de valorisation des ressources phytogntiques. Facult
des sciences de la nature et de la vie. Universit Mentouri de Constantine.
Devant le jury :
Prsident : Mr Benlaribi M.
Rapporteur : Mr Merghem R.
Examinateur : Mr Arhab R.
Examinateur : Mr Belkhiri A. M.
Prof. Univ. Constantine
Prof. Univ. Constantine
M. C. Univ. Tebessa
M. C. Univ. Constantine
Anne universitaire : 2008/2009