I.

EXTRACTION DE LA FRACTION SOLUBLE DE LA LEVURE DE BOULANGERIE

-

Broyer dans un mortier pendant 5 min, 40 g de levure en prsence de 10 ml deau.

Ajouter ensuite 10 ml dH2O et continuer le broyage pendant 5 minutes, pour briser la
membrane rsistante des cellules de levure. Il est recommand de broyer nergiquement ou
ajouter de lalumine pour faciliter lextraction.
Ajouter 80 ml deau distille.
Centrifuger la suspension cellulaire 10 minutes 4500 tours par minute.
Aprs centrifugation, rcuprer la phase liquide ou le surnageant qui contient les molcules
solubles des cellules entre autres linvertase. Jeter le culot solide form de dbris cellulaires
et garder le surnageant pour les manipulations ultrieures.

II. ETABLISSEMENT DE LA COURBE ETALON.

Concentrations des sucres invertis connues (Glu et Fru) en fonction de la densit optique (DO).
2.1. Matriel et Ractifs.
-

Eprouvette de 50 ml
Pipettes gradues
Support de tubes essai
Tubes essai
Spectrophotomtre
Solution de Glucose 2,5 mM
Solution de Fructose 2,5 mM
Solution de DNS

2.2. Mode opratoire.

Prparer une gamme talon partir dune solution mre de glucose+fructose de concentration de
5 mM selon le tableau ci-dessous. Dosage des sucres inverti par la mthode de DNS:
N tube

012345

(Glucose+Fructose) 5 mM (ml)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

H2O (ml)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

DNS (ml)

111111

Chauffage pendant 5 mn 100C

H2O (ml)

888888

Agiter, lire la DO 540 nm

C - Compte rendu
-

Tracer la courbe DO = f(S) c..d. la densit optique en fonction de la quantit des sucres en
portant (en ordonne) la densit optique de labsorption des sucres en fonction des
micromoles de sucres (en abscisses).

Etablir la pente de la droite.

III. DOSAGE DES PROTEINES PAR LA METHODES BRADFORD.

MANIPULATION II : MESURE DE LACTIVITE DE LINVERTASE EN FONCTION DU TEMPS

1. PRINCIPE
Lextrait cellulaire contenant linvertase (E) est incub en prsence de saccharose (S) pendant un
temps dtermin. Aprs chaque incubation, on arrte la raction de linvertase au moment voulu par
addition de soude en ramenant le pH une valeur o cette enzyme nest plus active.
Lactivit de cette enzyme est mesure en dosant la quantit des sucres invertis aprs hydrolyse
du saccharose apparu au cours de la raction en prsence du DNS.
II - MESURE DE LACTIVITE DE LINVERTASE EN FONCTION DU TEMPS.
Une fois lactivit invertase est mise en vidence dans la fraction soluble de la levure, ltude
cintique de cette activit peut tre faite en variant chaque fois lun des paramtres suivants :
quantit denzyme, temps dincubation, quantit du substrat, temprature, pH, force ionique etc.
2.1 - MATERIELS ET REACTIFS.
-

Tubes essai
Support de tubes essai
Pipettes de 1, 2 et 5 ml
Solution dacide actique 0,3 %

2 - MODE OPERATOIRE.
-

Raliser dans un erlenmeyer de 200 ml un mlange contenant 60 ml de saccharose 0,36 M,

5 ml dacide actique 0,3% et 5 ml deau distille.
Mettre lerlenmeyer dans le bain marie 56C.
Pr-incuber lerlenmeyer pendant 5 minutes et ajouter 5 ml dextrait enzymatique, agiter
doucement et noter le temps zro de la raction.
Au temps 2, 5, 10, 15, 20 et 30 mn prlever 0,2 ml partir de chaque tube, puis agiter les
tubes instantanment.
Doser la quantit des sucres apparus au cours de la raction comme indiqu dans le tableau
ci-dessous.

Temps (mn) Blanc 0 2 5 10 15 20 30

MR (ml) 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
MR : milieu ractionnel en ml pour le dosage des sucres

Incuber les tubes 100C pendant 10 mn.

Ajouter 1,6 ml de H2O ; agiter les tubes.
Mesurer la densit optique 550 nm contre le blanc.

3 - COMPTE RENDU.
-

Tracer la courbe V = f(t) en portant en ordonne le nombre de micromoles de saccharose

hydrolys et en abscisses le temps dincubation en minute. Interprter la courbe.
Dterminer lactivit de linvertase dans le surnageant.

MANIPULATION III: INFLUENCE DE LA CONCENTRATION DE LENZYME SUR SON ACTIVITE.

I - INFLUENCE DE LA QUANTITE DE LENZYME SUR LACTIVITE DE LINVERTASE
1.1. MODE OPERATOIRE.
- Prparer les tubes n 1 7 comme indiqu dans le tableau ci dessous.
- Mettre en dernier lieu lextrait enzymatique successivement dans les tubes n1, 2, 3, 4, 5, 6
et 7, en agitant rapidement chaque addition denzyme :
- Noter le temps zro de la raction.
N du tube

1234567

Saccharose 4% (ml)

3333333

CH3COOH 0,3% (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Eau (ml) 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3

Pr-incubation pendant 5 mn 56C
Extrait enzymatique dilu au 1/50 (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Incubation pendant 10 mn 56C
Prise en ml pour le dosage du glucose 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Solution de DNS 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubation pendant 10 mn 100C
Ajouter 1,6 ml deau distille ; agiter et faire la lecture de la DO 550 nm
1.2. RESULTATS.
- Tracer la courbe vi = f(E) en portant en ordonnes le nombre de micromoles de saccharose
hydrolys par mn (vi) en fonction des microgrammes de protines enzymatiques en
abscisses.
- Interprter la courbe

II - INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN SUBSTRAT SUR

2.1. LACTIVITE DE LINVERTASE
Des volumes constants renfermant des quantits variables de substrat seront tests de faon
dterminer la concentration en substrat (KM) pour laquelle en obtient la moiti de la VM.
2.2. MODE OPERATOIRE.
-

Prparer les solutions mres de saccharose 0,36 M et 1,2 M.

Prparer les tubes n 1 7 comme indiqu dans le tableau ci dessous.
Mettre en dernier lieu lextrait enzymatique successivement dans les tubes n1, 2, 3, 4, 5, 6
et 7 en agitant rapidement chaque addition denzyme.
Noter le temps zro de la raction.

NB : 2 concentrations de saccharose vont tre utilises (2 % et 4 %).

N du tube 1 2 3 4 5 6 7
Saccharose 0,36 M (ml) 1 2 3 4 0 0 0
Saccharose 1,2 M (ml) 0 0 0 0 2,5 3 4
CH3COOH 0,3% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau (ml) 5,5 4,5 3,5 2,5 4 3,5 2,5
Princubation pendant 5 mn 56C
Extrait enzymatique dilu au 1/50 (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubation pendant 10 mn 56C
Prise en ml pour le dosage du glucose 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Solution de DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubation pendant 10 mn 100C
Ajouter 1,6 ml deau distille ; agiter et faire la lecture de la DO 550nm
NB : faire un tmoin pour chaque concentration
2.3. Rsultats.
-

Broyer dans un mortier pendant 5 min, 40 g de levure en prsence de 10 ml deau.

Tracer le graphique V=f (S).
Tracer le graphique 1/V= f (1/S).
Dterminer KM et Vmax.

2.4. Compte rendu

- Influence de la quantit denzyme sur lactivit de linvertase.

Broyer dans un mortier pendant 5 min, 40 g de levure en prsence de 10 ml deau.

Tracer le graphique V = f(S) en portant en ordonnes le nombre de micromoles de glucose
apparu par mn (V) en fonction de la quantit en (microgrammes) de protines enzymatiques
par tube, en abscisses. Interprter les rsultats.
En dduire la zone de dilution pour laquelle la vitesse de raction est une fonction linaire de
la concentration en enzyme.
Choisir le volume dextrait enzymatique utiliser pour la suite des expriences.
Si lon veut utiliser 0,5 ml de la solution enzymatique par exprience, quelle dilution de votre
extrait enzymatique proposer vous ?

- Influence de la concentration en substrat sur lactivit de linvertase

-

Tracer un graphique V = f(S) en portant en ordonne le nombre de micromoles de glucose

produit par minute et en abscisses la concentration en saccharose dans le milieu ractionnel,
en sachant que la masse molaire du saccharose est de 342 g.
Interprter les rsultats obtenus.
Tracer le graphique 1/V = f (1/S).
Dterminer KM et VM

MANIPULATION IV : INFLUENCE DU pH SUR LACTIVITE DE LINVERTASE.

I. PRINCIPE.
Lenzyme tant une protine qui possde plusieurs groupements ionisables, la variation du pH du
milieu modifiera ltat dionisation de ces groupements, (la charge nette de la protine), et ainsi le
site actif de lenzyme ou son voisinage immdiat. Pour viter linfluence du pH, on se placera la
condition de saturation en substrat.
II. MATERIEL ET REACTIFS.
-

Spectrophotomtre
Burette
Pipettes 1, 2, 5 et 10 ml
Tubes essai
Phosphate disodique 0,2 M
Saccharose 0,36 M
Acide citrique 0,1 M
Solutions de tampon citrate phosphate des pH diffrents

Prparation des tampons :

-

Solution A : Acide citrique 0,1M : C6H8O7, anhydre: 19, 21 g/l ou C6H8O7, H2O: 21, 01 g/l
Solution B : Phosphate disodique 0,2 M : Na2HPO4, anhydre 28,4 g/l ou Na2HPO4, 7 H2O 53,65
g/l ou Na2HPO4, 12 H2O 71,7 g/l

NB : Toute la verrerie doit tre rigoureusement sche

On prpare le tampon dsir un pH donn en mlangeant : X ml sol. A + y ml sol. B et en

compltant 100 ml selon le tableau suivant:
pH X (ml) de A Y (ml) de B
2,6
3,4
4,2
5
5,8
6,6
44,6
35,9
29,4
24,3
19,7
16,6
5,4
14,1
20,6
25,7
30,3
36,4
III. MODE OPERATOIRE.
-

Prparer les tubes n1 6 indiqu dans le tableau ci-dessous .

mettre lextrait enzymatique en dernier lieu et en mme temps dans tous les tubes
Agiter les tubes et les mettre au bain-marie 56C.
Noter le temps zro de la raction.

N Tube 1 2 3 4 5 6
Saccharose 0,36M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Tampon (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Valeur du pH 2,6 3,4 4,2 5 5,8 6,6

Pr-incubation pendant 5 mn 56C
Extrait enzymatique dilu au 1/50 (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubation pendant 5 mn 56C
Prise dessai pour dosage des sucres (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Solution de DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubation pendant 5 mn 100C
Ajouter 1,6 ml dH2O, Agiter
Faire la Lecture de la DO 550 nm
-Doser la quantit de glucose apparu.
Rsultats:
-

Dterminer KM et VM
Tracer le graphique v = f (pH)
Dterminer la valeur du pH optimum pour lactivit enzymatique.

Compte rendu:
-

N du Tube 1 2 3 4 5 6 pH
Nombre de micro moles de glucose form
Nombre de micro moles de saccharose hydrolys par mn
Tracer le graphique v = f (pH) en portant en ordonnes le nombre de micro moles de
saccharose hydrolys par minute et en abscisses la valeur du pH.
Dterminer la valeur du pH optimum de lactivit enzymatique

MANIPULATION V : INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR L'ACTIVITE DE L'INVERTASE

I. PRINCIPE.
Les protines sont thermolabiles, leur structure native est tributaire des liaisons hydrogne et
hydrophobe. La temprature a un double effet sur lactivit enzymatique :
- Accroissement de la vitesse de raction en fonction de laugmentation de temprature (effet
rversible).
- Dnaturation de lenzyme partir dune temprature suffisamment leve (effet irrversible).
II. MODE OPERATOIRE.
-

Prparer une solution de saccharose 0,36 M

Prparer les tubes de 1 8 comme indiqu dans le tableau n1.

Mettre en dernier lieu lextrait enzymatique en mme temps dans tous les tubes. Agiter les
tubes et les incuber chacun la temprature indique. Noter le temps Zro de la raction.
Tableau n1
n du Tube 1 2 3 4 5 6 7
Saccharose 0,36 M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau distille (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
CH3COOH 0,3% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Extrait enzymatique dilu au 1/50 (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubation pendant 10mn la Temprature indique (C) 4 37 50 56 60 80 100
Prise dessai du milieu ractionnel (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Ajouter la solution de
DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incuber pendant 10 mn 100C
Ajouter H2O (ml) 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6
Lecture de la DO 550 nm
-

Doser la quantit de glucose apparu par le DNS.

NB : Etant donn que la temprature optimale de lactivit de linvertase est 56C, il est
recommand de diluer au les milieux ractionnels des tubes 4, 5 et 6 (0,1 ml du MR + 0,1
ml dH2O).
Raliser pour chaque temprature un tmoin sans invertase.

Rsultats.
-

Tracer le graphique de V = f (T)

Dterminer la temprature optimale pour lactivit enzymatique.

Compte rendu.
-

N du Tube 1 2 3 4 5 6 7 PH
Nombre de micro moles des sucres forms
Nombre de micro moles de saccharose hydrolys par minute
Tracer le graphique v = f (T) en portant en ordonnes le nombre de micromoles de
saccharose hydrolys par minute et en abscisse la temprature (C).
Dterminer la temprature optimale de lactivit enzymatique.
Que peut-on dduire aux tempratures extrmes ?

MANIPULATION VI:
INFLUENCE D'UN INHIBITEUR SUR L'ACTIVITE DE L'INVERTASE.
1 - GENERALITES
Les inhibiteurs ont pour effet de diminuer la vitesse dune raction enzymatique en formant des
complexes avec lenzyme, dissociables ou non.
Linhibition peut tre partielle au totale. Pour des raisons de simplicit nous ntudierons que les
inhibiteurs totaux dus des complexes dissociables.
Il existe dans cette catgorie diffrents types dinhibition :
- Inhibition comptitive
Lenzyme sassocie rversiblement au substrat S ou linhibiteur I, mais il ny a pas formation de
complexe ternaire. Linhibiteur occupe la place du substrat sur le site actif de lenzyme. Dans ce cas la
VMax de la raction nest pas modifie, seule la constante apparente de Michaelis varie et devient
gale :
(1 ) I M M k
k=k+I
La prsence de linhibiteur comptitif correspond une augmentation de KM, cest dire une
diminution de laffinit du substrat pour lenzyme. Les inhibiteurs organiques ayant une analogie de
structure avec le substrat sont comptitifs. Exemples d'inhibiteurs comptitifs : acides
hydroxamiques,
phenylure, chloramphnicol, phenylalanine, hydroxyre, hydroxylamine et
thioure.
- Inhibition non comptitive :
Les diffrents complexes ES, EI, EIS et ESI se forment. Ce type dinhibition se produit lorsque
linhibiteur se fixe sur lenzyme un emplacement diffrent du site de fixation du substrat, sans
entraner de variation dans laffinit apparente de lenzyme pour le substrat. La constante de
Michaelis nest pas modifie, seule la vitesse maximale de la raction varie en fonction de la
concentration de linhibiteur.

- Inhibition incompetitive:
Linhibiteur ne sassocie, quune fois le complexe enzyme substrat form, pour donner un complexe
ternaire inactive. La constante de Michaelis et la vitesse

maximale apparente varient de la mme manire en fonction de la concentration

de linhibiteur.
2 - PRINCIPE
Les sels de mtaux lourds, comme Cu2+, Hg2+ et Ag+ sont des inhibiteurs rversibles de linvertase.
Cette inhibition est fonction de la concentration en inhibiteur, mais nest pas en fonction du temps.
On peut rcuprer lactivit initiale en cheminant les mtaux lourds par dialyse ou par addition
dagents complexant ces ions.

3 - MATERIAL ET METHODES
Mme matriel et ractifs, avec en plus une solution de chlorure mercurique ou de paramercuribenzoate de sodium.
-Hg Cl2 10-4M
-Hg Cl2 10-5M
-Hg Cl2 10-6M

4 - MODE OPERATOIRE
- Prparer les tubes 1 15 comme indiqu sur le tableau n5 (mme protocole que pour la
dtermination du KM).
- Mettre lextrait enzymatique en dernier lieu et noter le temps zro de la raction.
- Doser la quantit des sucres apparus par le DNS. Prlever 0,2 ml et raliser la raction enzymatique
du dosage des sucres invertis comme indiqu dans le tableau n6.

N du tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Saccharose 2% (ml) 2 3 4 2 3 4 2 3 4
Saccharose 4% (ml) 2,5 3 2,5 3 2,5 3
CH3COOH 0,3% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
H2O (ml) 4 3 2 3,5 3 4 3 2 3,5 3 4 3 2 3,5 3
HgCl2 10-4M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
HgCl2 10-5M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

HgCl2 10-6M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Extrait enzymatique dilu au 1/50 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 (ml)
Incubation pendant 10 56C
Prise dessai 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Solution DNS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
H2O (ml) 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6
Mesurer la DO 550 nm
Tube Blanc Etalon 1g/l de glucose
Echantillon: tubes de 1 15 dilus 20 fois
Prise en ml pour dosage du glucose - 0,2 0,2
Solution de DNS (ml) 0,2 0,2 0,2
- Mesurer la densit optique 550 nm contre le blanc.