Cours Boucheloukh
Cours Boucheloukh
Département de Chimie
Cours
Méthodes d’Analyses
Chromatographiques
Préface............................................................................................................................ 1
Chapitre I
Généralité sur la chromatographie
1. Définition……………………...………………..…………………………………... 2
2. Historique ……………………………………………………………………..……. 2
3. Classification des techniques chromatographiques…………………...…………..... 3
3.1. Classification selon la nature physique des phases…………………………... 3
3.2. Classification selon le mécanisme de rétention………….…………………… 3
3.3. Classification selon la technique mise en jeu ……………………… ……….. 3
4. Choix de la technique ………………………………………...…………………….. 4
5. Terminologie et grandeurs de rétention…..……………….…………….………….. 5
5. 1. Chromatogramme……………………………………………………………. 5
5. 2. Elution ………………………………………………………………………. 5
5. 3. Le temps mort ……………………………………………………………….. 5
5. 4. Le temps de rétention ………………………………………......................... 5
5. 5. Le temps de rétention réduit…………………………………………………. 6
5. 6. Le volume de rétention.……………………………………………………… 6
5. 7. Vitesse linéaire moyenne du soluté et de la phase mobile…………………... 7
5.8. Le facteur de capacité ………………………….…………..………………… 7
5.9. Facteur de sélectivité…………………………………………..……………... 8
6. Efficacité d’une colonne……………………………………………………………. 8
7. Résolution………………………………………………….………………………. 10
8. Equation de Van Deemter …………………….…………………………………… 11
9. Optimisation d’une analyse chromatographique ……..……………………………. 12
Exercices………………………………………………………………………………. 13
Chapitre II
Chromatographie liquide classique
1. Chromatographie sur Colonne………………………..….……………………….... 15
1.1. Introduction…………………………………...……………………………... 15
1.2. Description de la méthode…………………………………………………… 15
1.3. Phase stationnaire……………………………………………………………. 15
1.4. Eluant………………………………………………………………………… 16
i
1.5. Vitesse d’élution……………………………………………………………... 16
1.6. Dimension de la colonne…………………………………………………….. 17
1.7. Remplissage de la colonne…………………………………………………… 17
1.8. Dépôt de l’échantillon………………………………………………………... 18
1.9. Alimentation en solvant……………………………………………………… 18
1.10. Analyse des fractions……………………………………………………….. 18
Exercices ………………………………………………………………………..... 20
2. Chromatographie sur couche mince………….……..……………………………… 21
2.1. Définition………………………...…………………….…………………….. 21
2.2. Appareillage……………………...…………………………………………... 21
2.3. Adsorbant ……………………………….....………………………………… 22
2.4. L’éluant………………………………………….…………………………… 23
2.5. Dépôt de l’échantillon……...………………………………………………… 23
2.6. Développement de la plaque……………………...………………………….. 23
2.7. Révélation…………………………..………………………………………... 24
2.8. Paramètre de séparation……………………………………………………… 24
2.9 Efficacité d’une plaque CCM………………………………...………………. 25
Exercices………………………………………………………………………...... 26
3. Chromatographie sur papier…………….…………………………………………. 28
3.1. Introduction……………….………………………………………………………. 28
3.2. Principe………..………………………………………………………………….. 28
3.3. Papier…...………………………………………………………………………… 28
Chapitre III
Chromatographie liquide haute performance
1. Chromatographie liquide haute performance…………......……………………….. 30
1.1. Introduction…………………………………………………………………. 30
1.2. Appareillage…………………………………………….…………………… 30
1.3. Réservoir de solvants………………………………………………………… 31
1.4. Dispositif de dégazage ………………………………….…………………… 32
1.5. Pompe ………………………………………...……………………………... 32
1.6. Injecteur………...……………………………………………………………. 33
1.7. Colonne…...………………………………………………………………….. 34
1.7.1. Les thermostats des colonnes………………...……………………………. 34
ii
1.8. Détecteurs……………………...…………………………………………….. 35
1.8.1. Photomètre UV-Visible……………………………………………………. 35
1.8.2. Réfractomètre différentiel.…………………………………………………. 36
1.8.3 Détecteur fluorimétrique……………………………………………………. 36
1.8.4 Détecteur électrochimique………………………………………………….. 36
1.8.5 Détecteur par spectroscopie de masse……………………………………… 37
1.9. Interactions moléculaire entre phase mobile et soluté……………………….. 37
1.10. Force éluant et polarité………………………...…………………………… 37
Exercices………………………………………………………………………….. 38
2. Chromatographie d’adsorption………………….…………………………….. 38
2.1. L’adsorption………………….……………………………………………… 38
2.2. La chromatographie d’adsorption………………………….………………… 39
2.3. Les adsorbants…………………………………………………….……… 39
2.4. Phase mobile………………………………………………….……………… 41
3. Chromatographie de partage………………………………………………….. 43
3.1. Introduction…………………………………………………………… 43
3.2. Support………………………………………………………………... 44
3.3. Phase stationnaire…………………………………………………….. 44
3.4. Phase mobile………………………………………………………….. 46
Exercices…………………………………………………………………… 46
4. La chromatographie d'échange d'ions…………………...…………………….. 49
4.1. Définition……….……………………………………………………………. 49
4.2. Principe de la méthode…….…………………………………………………. 49
4.3. La phase stationnaire………………………………….……………………... 49
4.4. Les supports………………………………………………………………….. 51
4.5. La phase mobile………….…………………………………………………... 52
4.6. Détection…….……………………………………………………………….. 53
Exercices………………………………………………………………………….. 55
5. La chromatographie d'exclusion…….………………………………………… 56
5.1. Définition………….…………………………………………………………. 56
5.2. Principe de la chromatographie d’exclusion…………………………………. 56
5.3 Phase stationnaire…………………………………………………………….. 57
5.4. Caractère et nature des gels………………………………………….………. 57
iii
5.5. Phase mobile……….………………………………………………………… 59
5.6. Détection……………………………………….…………………………….. 60
Exercices………………………………………………………………………….. 61
6. La chromatographie d'affinité………..……………………………………...… 63
6.1. Introduction..………………………………………………………………… 63
6.2. Etapes d’une chromatographie d’affinité……………..……………………… 63
6.3. L’intéraction protéine-ligand………………………………………………… 65
6.4. Phase stationnaire………………….………………………………………… 65
6.5. Avantages et inconvénient de la méthode .………………………………….. 66
Chapitre IV
iv
III.3. Détecteurs sélectifs…………………………………………………………. 81
III.4. Modification par un processus réactionnel…………………………………. 81
III.5. Couplage à d’autres méthodes……………………………………………… 81
IV. L’analyse quantitative………………………………………………………... 81
IV.1. Les méthodes d’analyse quantitative……………………………………….. 82
Exercices………………………………………………………………………….. 86
Chapitre V
L’électrophorèse Capillaire
1. Définition………………………………………………………………………. 92
2. Mobilité électrophorétique et électro-osmotique ……..…………...…………... 93
2.1. Mobilité électrophorétique…………………………………………………… 93
2.2. Mobilité électro-osmotique…………………………………………………... 94
3. Mobilité apparente……………………………..………………………………. 95
4. Modes d’injection……………………………………………………………… 96
5. Modes de détection…………………………………………………………….. 96
Exercices………………………………………………………………………….. 97
Correction des exercices… ………………………………………………………. 98
Références bibliographiques..………..…………………………………………... 102
v
Préface
Préface
1
CHAPITRE I
Chapitre I
1. Définition
2. Historique
La chromatographie est une science très ancienne. Aristote décrit les propriétés que
possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Au XVIème siècle, le strasbourgeois
Brunswig purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à travers une éponge imprégnée
d'huile d'olive et réalisait une expérience de chromatographie gaz-liquide, 400 ans avant la
découverte de cette technique. En 1931, la publication de Kuhn et Lederer sur la séparation
des isomères du carotène et de la xanthopylle apparue. En effet, c’est Kuhn qui, en 1938
reçut le Prix Nobel sur la chromatographie en phase mince.
En 1952, les travaux de Martin ont mis en évidence la chromatographie d’échange ionique
et en 1941 la naissance de la chromatographie de partage par Martin-Synge. En 1955 la
chromatographie gaz-liquide sur le marché et en 1965 l’apparition la chromatographie
liquide moderne (HPLC). L’excellente séparation des molécules, aussi bien les grosses que
les petites rend la chromatographie une technique largement répandue.
2
Généralités sur la Chromatographie
3
Généralités sur la Chromatographie
4. Choix de la technique
Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes. Le choix de l’une
ou l’autre dépend :
1. de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide,
macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,…
2. du but de l’analyse : identification, contrôle de pureté, purification de produits
(colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres,
dosages, quantification…
Échantillon de MM 2000
Chromato. de partage
Chromato. Chromato. de partage phase inverse
d’adsorption phase normale
4
Généralités sur la Chromatographie
5.1. Chromatogramme
5.2. Elution
L’élution est l’entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de
la phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile peut être appelée
éluant.
Le temps mot (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire de
la colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne (ou temps mis par
la phase mobile pour traverser la colonne).
Le temps de rétention (tr) est le temps mis par les molécules d’un composé à analyser
(soluté) pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne. Le temps de
rétention est caractéristique d’une espèce pour des conditions d’analyse données et peuvent
servir à l’analyse qualitative. La surface et la hauteur d’un pic est fonction de la quantité du
5
Généralités sur la Chromatographie
Le temps de rétention réduit (tr’) représente le temps passé par le soluté dans la phase
stationnaire.
tr H
75
50
mAU
ω
25
3,264
10,848
0
l
0 5 10 15
M inutes
6
Généralités sur la Chromatographie
Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume mort) peut être
calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non retenu par la
phase stationnaire. Cette grandeur est exprimée par :
L : longueur de la colonne
La vitesse linéaire moyenne de la phase mobile u est égale à :
( )
k' est aussi le rapport du temps passé par une espèce dans la phase stationnaire au temps
passé par cette même espèce dans la phase mobile.
7
Généralités sur la Chromatographie
De faibles valeurs de k’ indiquent des composés peu retenus. Des valeurs élevées de k’
indiquent des composés fortement retenus, en pratique 1 k’10.
Le temps et le volume de rétention sont liés au facteur de capacité par les relations :
( )
et
( )
Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on utilise le facteur de
sélectivité ou de séparation . Ce facteur est égal au rapport des facteurs de capacité de
deux solutés dont on veut réaliser la séparation. Il s’exprime par :
( )
⁄
( )
L'efficacité d'une colonne chromatographique est mesurée, pour chaque composé, par le
nombre de plateaux théoriques N de la colonne et la hauteur équivalente à un plateau
théorique H. Cette théorie est née de la recherche d'un modèle statique permettant de
décrire le fonctionnement d'une colonne chromatographique comme celui d'une colonne à
distiller. Au lieu de considérer le déplacement réel, continu de la phase mobile, on admet
que celle-ci progresse par sauts successifs et se met en équilibre avec la phase stationnaire
8
Généralités sur la Chromatographie
9
Généralités sur la Chromatographie
7. Résolution
La résolution de deux pics voisins est définie par le rapport de la distance entre le
maximum des deux pics et la moyenne arithmétique.
Deux caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des pics
a) la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tr2-tr1
b) la largeur des pics à la base l
( )
( )
10
Généralités sur la Chromatographie
30
20
8,651
3,669
mAU
10
1,973
6,507
4,011
0
L’équation ci-dessus correspond à celle proposée par Van Deemter et al. (1956) pour la
chromatographie en phase gazeuse
La courbe représentant l’équation de Van Deemter est donc une hyperbole ou A, B, C sont
des constantes.
u: vitesse moyenne de la phase mobile (gaz vecteur).
A : est l'influence de la diffusion turbulente due aux hétérogénéités dans l'écoulement.
B : est un facteur de la diffusion moléculaire dans la phase mobile.
C : dépend de la résistance au transfert de masse en phase liquide
11
Généralités sur la Chromatographie
HEPT
Hmin
uopt u (cm/s)
Aux faibles valeurs de u, le terme B/u prédomine (la courbe devient asymptote à une droite
de pente négative) et explique la perte d’efficacité vers les très faibles vitesses. Aux
grandes vitesses, le terme C.u prédomine (la courbe devient asymptote à une droite de
pente positive) et explique la perte d’efficacité aux très grandes vitesses. Dans la région
intermédiaire, le terme A est prépondérant et H passe par un minimum (Hmin). Elle montre
que la variation de H en fonction de u passe par une valeur minimale calculée en cherchant
la valeur de u correspondant à l’annulation de la dérivée première de cette fonction :
uopt √
La résolution et le temps d’élution sont les deux variables dépendantes les plus importantes
à considérer. Dans toute optimisation, le but est de réussir une séparation suffisante des
composés intéressants en un minimum de temps. Dans la pratique, on s'efforcera d'abord de
choisir les conditions chimiques de la séparation (nature et composition chimique de la
phase stationnaire, nature et composition chimique de l'éluant, modification éventuelle des
12
Généralités sur la Chromatographie
produits à séparer) pour que le facteur de sélectivité ne soit pas trop proche de 1 et pour que
les facteurs de capacité soient compris entre 1 et 10.
Applications de la chromatographie
La chromatographie est un outil puissant et polyvalent pour séparer des espèces chimiques
très voisines. Elle peut également être utilisée tant pour l’identification qualitative que pour
l’analyse quantitative d’espèces individuelles.
Exercices
Exercice 1
Calculer le facteur de séparation entre deux composés 1 et 2 dont les volumes de rétention
sont respectivement égaux à 6 et 7 ml. Le volume mort de la colonne utilisé est de 1mL.
Exercice 2
Une colonne tubulaire ouverte utilisée pour la séparation d’un mélange a un diamètre
intérieur de 0,25 mm. On utilise une vitesse d’écoulement volumétrique de 1,0 mL/min.
Calculer la vitesse d’écoulement linéaire en cm/s à la sortie de la colonne.
Exercice 3
Exercice 4
a) Quelle est la vitesse linéaire moyenne de la phase mobile qui minimise la hauteur
d’un plateau théorique?
b) Quel serait la hauteur minimale équivalente à un plateau théorique de la colonne ?
13
Généralités sur la Chromatographie
Exercice 5
Données expérimentales :
trm = 60s
14
CHAPITRE II
Chapitre II
1.1. Introduction
La chromatographie sur colonne est une méthode préparative qui permet de séparer et
d'isoler les constituants d'un mélange. Cette technique est fondée principalement sur des
phénomènes d'adsorption et permet de séparer pratiquement tous les mélanges possibles. Il
suffit de trouver les bonnes conditions.
Une grande surface spécifique de l’adsorbant est souhaitable pour obtenir de meilleures
séparations. Les adsorbants les plus utilisés sont :
L'alumine (Al2O3) sous forme acide, basique ou neutre. Cet adsorbant ne peut être
employé qu'avec des composés organiques stables (l'alumine acide entraîne la
15
Chromatographie sur Colonne
déshydratation des alcools tertiaires, l'alumine basique entraîne l'hydrolyse des esters).
L'alumine est un adsorbant polaire ; le constituant le plus polaire sera le plus fortement fixé
et c'est le constituant le moins polaire qui sera élué le premier.
Gel de silice (SiO2), se présente sous forme d’une poudre blanche utilisée en particulier
pour séparer des composés organiques qui n'ont pas une stabilité suffisante pour être
séparés sur l’alumine. La granulométrie d'un adsorbant employé en chromatographie sur
colonne est plus importante que celle d'un adsorbant employé en CCM (80 à 200 m au
lieu de 70 m). Les adsorbants suivants sont classés selon l’ordre croissant de leurs forces
d’interactions avec les composés polaires : papier, cellulose, amidon, sucres, carbonate de
sodium, oxyde de magnésium, gel de silice, alumine, charbon activé.
1.4. Eluant
La vitesse d’élution doit être la plus constante possible; elle doit être suffisamment lente
pour que le soluté soit plus près de l’équilibre entre les phases mobile et stationnaire. Si la
vitesse d'élution est trop faible, les constituants diffusent dans l'éluant. Le chromatogramme
présente alors des bandes larges et la séparation est médiocre ; une vitesse d'élution élevé
n’est autorisée que dans le cas où les substances à séparer ont des polarités très voisines.
16
Chromatographie sur Colonne
La hauteur de la colonne est égale à sept à dix fois le diamètre intérieur de la colonne. Il
faut laisser un espace libre d'environ 10 cm au-dessus de l'adsorbant pour faire couler le
solvant. Les colonnes classiques ont à leur base une plaque de verre fritté qui permet
l’écoulement libre de l’éluant tout en empêchant le passage de l’adsorbant (Fig.1.1). On
peut utiliser une burette, au fond de laquelle on place du coton.
Remplissage par voie sèche: on remplit la colonne au deux tiers avec le moins polaire des
deux solvants puis on ajoute l'adsorbant en poudre par petites portions successives.
17
Chromatographie sur Colonne
Si l'échantillon est liquide, il est déposé tel quel. Si l'échantillon est solide, on le dissout
dans un minimum du moins polaire des deux solvants. On ajuste d'abord le niveau du
solvant pour qu'il soit juste au-dessus de la surface supérieure de l'adsorbant. Ensuite,
robinet fermé, on coule l'échantillon (pur ou en solution très concentrée) au sommet de la
colonne en essayant de le distribuer de la façon la plus uniforme possible sur les bords de la
colonne. On ouvre le robinet un court instant de façon que l'échantillon pénètre dans la
colonne et soit adsorbé en une zone cylindrique de faible épaisseur au sommet de la
colonne.
Lorsque les composés qui se séparent forment des zones colorées dans la colonne ou sont
fortement fluorescents aux U.V, il est facile de les repérer soit directement sur la colonne
soit dans les fractions recueillies. La récupération s'effectue alors simplement en réunissant
les fractions appropriées et en évaporant le solvant. Si les produits ne sont pas colorés,
après une analyse approprié (HPLC, CCM, IR et UV) réunir les fractions correspondant au
produit désiré et évaporer le solvant.
18
Chromatographie sur Colonne
Echantillon
Verre frité
Erlenmeyer
19
Chromatographie sur Colonne
Exercices
Exercice 1.1
On réalise une chromatographie sur colonne d’un sirop de menthe, puis on recueille
deux fractions colorées F1 et F2.
Les spectres d’absorption de ces fractions, ont l’allure ci-après.
Le colorant jaune tartrazine (E102) présente un maximum d’absorption pour la
longueur d’onde (E102) = 420 nm et le colorant bleu patenté (E131) présente un
maximum d’absorption pour la longueur d’onde (E131) = 625 nm. La chromatographie
a-t-elle permis de séparer complètement les deux constituants ? Justifier.
20
Chromatographie sur Couche Mince
2.1. Définition
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes
d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le
long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de
matière plastique ou d’aluminium.
Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à
une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. La figure 2.1 représente les
principaux éléments d’une séparation CCM.
2.2. Appareillage
21
Chromatographie sur Couche Mince
(a)
(b)
Couvercle
Cuve
Atmosphère saturée en
vapeur de solvant
(c)
Phase mobile
2.3. Adsorbants
Les adsorbants employés en CCM sont : le gel de silice, l’alumine et la cellulose. Ils sont
utilisés dans une granulométrie plus grande en chromatographie sur colonne. La taille des
grains, leur surface spécifique, le volume des pores, leur diamètre et la répartition
granulométrique définissent les propriétés des matériaux utilisés. Pour la nano-CCM, la
taille des particules est de l’ordre de 4 m et celle des pores de 6 nm.
22
Chromatographie sur Couche Mince
2.4. L’éluant
L’éluant peut être composé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants ; il ne doit pas
être ni trop polaire (entraînant les composants) ni trop apolaire (empêchant leur migration).
Les solvants sont caractérisés par leur différence de polarité et leur non miscibilité.
A l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire, on dépose une goutte de chaque
solution sur une plaque, chacune séparée de l’autre d’environ 1 cm. L’éluant qui aura
entraîné le soluté à une distance proche de la moitié de la plaque sera considéré comme bon
éluant.
Deux facteurs interviennent lors de l’interaction entre l’éluant et le soluté.
La solubilité : on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l’éluant pour que
la migration se fasse.
La polarité de l’éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre
De faible quantité de l’échantillon dissous dans un solvant volatil, qui n’est pas forcément
le même que l’éluant. On trace sur la plaque à 1 cm du bord inférieur un très fin trait au
crayon de papier qui servira à repérer les dépôts ; on veillera surtout à ne pas abîmer la
surface de la plaque. L’échantillon est déposé ensuite à l’aide de micropipette ou de tube
capillaire en un point sur le trait. Les produits non volatils sont aisément analysables ; les
composants de l’échantillon sont volatils : aldéhydes, cétones aliphatiques ou aromatiques,
acides monocarboxyliques, amines primaires ou secondaires ; nécessaire de les
chromatographies sous forme de sels.
La plaque préparée est introduite en position verticale dans la cuve et l’éluant qui en
recouvre le fond monte par capillarité, entraînant à des vitesses différentes les constituants à
23
Chromatographie sur Couche Mince
2.7. Révélation
Lorsque les composants de l’échantillon à analyser sont colorés, leur séparation est
facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire on doit rendre les taches visibles
par un procédé de révélation les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes
usuelles de révélation sont les suivantes :
Chaque substance est caractérisée par sa mobilité appelée rapport frontal (Fig. 2.3).
Le rapport frontal ou rétention frontale (Rf) de chaque composé est défini par le rapport :
24
Chromatographie sur Couche Mince
Front de solvant
y
x
Ligne de dépôt
Le Rf d’une substance est une constante et constitue une des caractéristiques physiques. On
peut donc se servir de cette valeur pour identifier une substance inconnue. Lorsque la
polarité de l’éluant augmente, le Rf augmente.
L’efficacité N d’une plaque CCM et la hauteur H de plateau théorique pour un composé est
donné par les relations :
et
25
Chromatographie sur Couche Mince
Applications
La CCM présente plusieurs applications ; elle permet le contrôle aisé et rapide de la pureté
d’un composé organique, le suivi de la réaction chimique ou d’un fractionnement
chromatographique sur colonne et la recherche du meilleur solvant, avant d’entamer une
séparation sur colonne classique. Elle permet également la purification de petites quantités
de produit (jusqu’à 100 mg). La bande qui contient le produit purifié est grattée, puis la
silice est extraite avec un solvant.
Le succès de ce mode de chromatographie est dû notamment à la facilité de sa mise en
œuvre et à la possibilité de son emploi dans le domaine analytique que dans le domaine
préparatif.
Exercices
Exercice 2.1
Un échantillon contenant deux composés A et B est séparé par CCM. Au bout de 15 min de
développement, le front du solvant est à 8,3 cm du départ, le composé A à 7,5cm et le
composé B à 2,3 cm. Calculer le Rf des deux composés.
Exercice 2.2
On réalise la chromatographie de trois encres. Une encre noire, notée A, une encre verte,
notée B et une encre bleue, notée C. Le chromatogramme obtenu est donné ci-dessous.
26
Chromatographie sur Couche Mince
A B C
Exercice 2.3
Un échantillon contient deux composés A et B séparé par CCM sur de la silice. Après
migration, la révélation conduit à deux taches. La migration du front de solvant dans cette
expérience est de 6 cm. Calculer :
a) Calculer Rf, N et H pour chacun des composés.
b) Calculer le facteur de résolution entre les deux composés A et B.
Sachant que : xA= 31 mm et wA= 1,5 mm
xB= 26 mm et wB= 2,2 mm
Exercice 2.4
On a réalisé la chromatographie de deux échantillons et d’une référence. L’exploitation du
chromatogramme a fourni les résultats suivants : - Front du solvant H= 8,0 cm - échantillon
A : deux taches situées à 3,0 cm et 4,0 cm de la ligne de base - échantillon B une tache
située à 5,0 cm de la ligne de base - référence le menthol M : Rf = 0,5
27
Chromatographie sur Papier
3.1. Introduction
La chromatographie sur papier (CP) est une chromatographie de partage liquide-liquide qui
permet de séparer et d’identifier les espèces chimiques d’un mélange. Actuellement, malgré
l’apparition de la CCM et la CLHP, la CP conserve toute sa valeur pour séparer des
substances très polaires. Cette méthode est basée sur leur différence d’affinité pour deux
phases : La phase stationnaire est constituée par l'eau elle-même, absorbée par la cellulose
du papier ou liée chimiquement à elle.
La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau.
3.2. Principe
L'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui se
déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables
selon leur solubilité (la technique ressemble à celle de la CCM). Généralement, les
composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par
liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc
lentement.
Ses plus grands inconvénients par rapport à la chromatographie sur couche mince sont : la
durée de développement beaucoup plus longue et une séparation généralement moins
bonne.
3.3. Papier
On peut employer du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du papier
conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques physiques
sont uniformes. Ce papier est suffisamment épais pour retenir par imprégnation une
quantité notable de phase stationnaire qui est en général aqueuse. Les marques principales
du papier trouvé dans le commerce sont Whatman, Schleider et Schüll, Durieux, Arches.
28
Chromatographie sur Papier
Il existe huit catégories de papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur
surface et la vitesse avec laquelle l'eau s'y diffuse. Par exemple, le papier Whatman n°1 est
le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d'écoulement, on emploiera le n°4 ; le
papier n°20 est très lent, mais il permet une meilleure séparation, donnant les taches très
denses et uniformes.
Applications
La CP est employé principalement pour l'analyse de composés très polaires, tels que les
acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels.
29
CHAPITRE III
Chapitre III
1.1. Introduction
1.2. Appareillage
30
Chromatographie Liquide Haute Performance
Dégazeur
Isocratique ou
Système de pompage
gradient d’élution
Phase stationnaire
Colonne
Thermostat
Collecteur de fraction
(Appareil Dionex)
Pour l’éluant on emploi un vase clos pour éviter l’évaporation. Le solvant utilisé doit
nécessairement :
a) Maintenir la stabilité de la colonne
b) Etre compatible avec le détecteur
c) Solubiliser suffisamment l’échantillon et ne pas gêner sa récupération.
Il est recommandé de toujours employer des solvants traité spécifiquement pour CLHP. Ils
doivent être dégazé et filtré avant usage sur filtre spécial (0,45 m). Le choix du solvant
constitue habituellement la partie la plus difficile de ce type de chromatographie. Il est
préférable de faire quelques essaies en CCM.
31
Chromatographie Liquide Haute Performance
1.5. Pompe
La pompe d’un chromatographe a pour rôle d’assurer l’écoulement de la phase mobile dans
la colonne. Tout appareil CLHP comporte au moins une pompe en mode isocratique (éluant
de composition fixe tout au long de l’analyse donc la phase mobile peut être préalablement
préparée et disposée dans un seul réservoir) ou en gradient d’élution (éluant de composition
variable). L’élution gradué lors de la séparation de mélanges complexes permet, en
modifiant la composition de l’éluant, d’optimiser les facteurs de capacité et de réduire les
temps d’analyse. Les pompes les plus utilisées sont les pompes de types piston avec
lesquelles les débits sont constants, la pression peut atteindre environ 500 bars.
1.6. Injecteur
L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se faire à l’aide une
vanne (boucle d’échantillonnage) : on introduit d’abord l’échantillon dans une boucle de
volume connu (position chargement ou Load) après rotation de la vanne de 60° d’un levier
qui permet d’inverser le sens de circulation dans la boucle (position Inject), la phase mobile
entraîne l’échantillon en tête de la colonne le volume injecté est constant, cela permet donc
de travailler en étalonnage externe pour une analyse quantitative. Le volume prélevé avec la
seringue est donc toujours largement supérieur à celui de la boucle. Aujourd’hui on utilise
des injecteurs automatiques.
2 6 2 1
1 Vers la colonne 6 Vers la colonne
3
5 1 3 1
4 45
Effluent
Injection
Boucle
Boucle
(a) (b)
33
Chromatographie Liquide Haute Performance
1.7. Colonne
Les colonnes CLHP sont généralement courtes et droites en acier inoxydable se caractérise
par leur géométrie (diamètre intérieur de 4 mm et une longueur de 5 à 30 cm) et par la
nature des phases qu’elles contiennent (Figure 1.4). Elles doivent capables de résister aux
fortes pressions. Le débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques mL/min. Ces
colonnes ont l’avantage de la rapidité de l’analyse, consomment moins de solvant et
conduisent à une meilleure résolution de l’analyse. Dans la plupart des analyses une pré-
colonne ou colonne de garde qui ne diffère de la colonne analytique que par sa très faible
longueur (1 à 2 cm pour une colonne de 25 cm) permet de protéger la colonne et d’en
augmenter la durée de fonctionnement.
34
Chromatographie Liquide Haute Performance
1.8. Détecteurs
35
Chromatographie Liquide Haute Performance
Il mesure l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une radiation ultraviolette.
L’émission de lumière est mesurée à angle droit du faisceau d’excitation. Ce procédé sert
pour les composés fluorescents ou les dérivés fluorescents de certains composés. Ce mode
de détection est plus sélectif et plus sensible de tous les détecteurs optiques à condition que
les composés présentent une fluorescence, qu’elle soit naturelle ou obtenue par formation
de dérivés.
36
Chromatographie Liquide Haute Performance
La polarité d’un échantillon et d’un solvant est la tendance de ces deux composés à
interagir fortement par polarité. Les composés polaires interagissent très fortement les uns
avec les autres. Pour les composés polaires :
Plus la phase mobile sera polaire, plus elle va entraîner les solutés
Plus la phase mobile sera apolaire, moins elle va entraîner les solutés
Applications
La CLHP est utilisée pour séparer et doser des espèces diverses d’analytes: inorganiques,
organiques et biologiques
37
Chromatographie Liquide Haute Performance
Exercices
Exercice 1.1
Les appareils actuels de CLHP peuvent utiliser des colonnes de 300 m de diamètre interne
pour lesquelles le débit optimum conseillé est de 4 L/min.
1. Montrer par un calcul simple que ce débit conduit pratiquement à la même vitesse
linéaire de la phase mobile que pour une colonne de même type mais d’un diamètre de 4,6
mm pour laquelle le débit conseillé est de 1 mL/min.
2. La séparation d’un échantillon comportant 16 HPA (hydrocarbures polyaromatiques) a
été effectuée sur une colonne de type C18 (L= 25 cm, d= 300 m). Le débit de la phase
mobile (acétonitrile/eau) est de 4 L/min. L’un de ces HPA a un temps de rétention de 48
min.
Calculer le volume de rétention de ce composé. Que peut-on en conclure?
Exercice 1.2
Calculer
1. La résolution de la colonne
2. Le nombre moyen de plateaux théoriques dans la colonne
3. La hauteur équivalente à un plateau théorique
4. La longueur de la colonne nécessaire pour obtenir une résolution de 1,5
5. Le temps requis pour éluer la substance B sur cette colonne.
38
Chromatographie d’Adsorption
2. Chromatographie d’adsorption
2.1. L’adsorption
Les adsorbants sont sous forme de fines granulométries 3 à 20 m. La séparation est
meilleure, mais plus lente si les grains sont fins. Plus un adsorbant est actif, plus il retient
fortement les composés polaires. La séparation se fait par ordre croissant de leurs forces
d’interaction avec les composés polaires. On distingue :
39
Chromatographie d’Adsorption
La surface spécifique des adsorbants correspond à leur surface d’adsorption par unité de
masse. Elle est liée à leur granulométrie et à leur porosité. Une grande surface spécifique
est souhaitable car elle permet d’obtenir de meilleures séparations. Les adsorbants les plus
couramment utilisés sont :
Silice (SiO2)
La silice provient de la déshydratation de l’acide silicique, elle se présente sous forme
d’une poudre blanche de très fine granulométrie. Le mécanisme de rétention sur cet
adsorbant résulte de la présence à la surface, de groupes silanols (-OH) et de groupes
siloxanes (-O) qui expliquent sa polarité, son caractère acide et la possibilité de former des
liaisons hydrogènes.
OH OH H H HO OH
O O
Si O Si Si
Si O Si
Alumine (Al2O3)
cet adsorbant est très utilisé car il présente de très bonnes propriétés d’adsorption, il
s’obtient par déshydratation de l’hydroxyde Al(OH)3 ; cet adsorbant est dit basique.
L'alumine convient bien pour la séparation de solutés acides (acides carboxyliques).
40
Chromatographie d’Adsorption
Al
Al O
O O
O Al O H C R
Al OH O O
O + R C Al O
Al O O O
O Al OH
Al OH
O
O Al
Al
Les molécules polaires sont toujours plus adsorbées que les molécules non polaires. Les
groupements fonctionnels classés selon un ordre de polarité décroissante sont fournis dans
la liste ci-dessous :
Amides > amines > acides carboxyliques >alcools > cétones > esters > composés nitrés >
éthers > hydrocarbures aromatiques > hydrocarbures non saturés > hydrocarbures saturés.
La silice convient pour les solutés qui sont des bases (les amines aliphatiques et
aromatiques). Inversement, l’alumine convient bien pour la séparation des solutés acides
comme : les phénols et les acides carboxyliques. Pour ces deux supports les molécules
polaires sont toujours les plus adsorbés.
Pour des molécules très polaires la chromatographie d’adsorption n’est pas adéquate car il y
a une très forte rétention d’où la nécessité d’utiliser la chromatographie de partage.
Il faut que le soluté soit soluble dans l’éluant pour que la migration se fasse et il est
possible de faire des mélanges de solvants pour changer sa polarité. Sous réserve de leur
miscibilité et de leur compatibilité avec le système de détection pour obtenir de bonne
séparation.
La plupart des séparations chromatographiques s’effectuent en adaptant la polarité de la
phase stationnaire à celle du soluté; on utilise par contre une phase mobile dont la polarité
est extrêmement différente.
41
Chromatographie d’Adsorption
Moins un composé est polaire, moins il s’accroche à l’adsorbant, plus il migre avec l’éluant
et plus un composé est polaire, plus il s’accroche à l’adsorbant, moins il migre avec
l’éluant. Plus de 90% des séparations en chromatographie d’adsorption utilisent un mélange
hexane ou isooctane avec l’éther isopropylique soit le chlorure de méthylène, acétonitrile et
méthanol.
Applications
42
Chromatographie de Partage
3. Chromatographie de partage
3.1. Introduction
La chromatographie de partage fonctionne par partage de solutés entre deux phases non
miscibles ; l’une mobile et l’autre stationnaire. La phase stationnaire est un liquide qui
imprègne un support en principe inerte ou est greffée par liaison chimique covalente sur ce
support. Cette technique s'apparente à l'extraction liquide/liquide basée sur les différences
de solubilités dans deux phases non miscibles, mais dans ce cas une des deux phases est
immobilisée sur un solide dont les particules ont des diamètres très petits. Il s’établit un
équilibre qui dépend de la solubilité relative du soluté dans les deux solvants donc du
coefficient de partage.
L’équilibre de répartition du soluté entre les deux phases mobile et stationnaire s’exprime
par l’équation:
et
43
Chromatographie de Partage
Si on a deux composés qui sont mal séparé en phase normale, donc on doit augmenter le
temps de rétention en diminuant la force de la phase mobile donc diminuer la polarité de la
phase mobile.
Mode b. La phase stationnaire est apolaire (mode inverse) et la phase mobile est un solvant
polaire.
3.2. Support
Ce sont des solides très finement divisés qui présente une très grande surface, afin de
retenir sous un petit volume une grande quantité de phase liquide.
Parmi les supports les plus utilisés, on peut citer :
Le gel de silice
Terre diatomées
La poudre de cellulose et un certain nombre de polymères synthétiques dérivés du
vinylbenzène
44
Chromatographie de Partage
l’usage de phase stationnaire chimiquement liées (greffées) en raison de leur plus grande
stabilité.
Selon la polarité de la phase stationnaire et mobile on peut distinguer :
La présence de fonctions particulières sur le greffage (-CN, -NH2,…) peut apporter une
sélectivité intéressante. De plus, il est possible de travailler avec un gradient de force
éluant, donc d'analyser en une seule fois des mélanges contenant des composés de polarités
très différentes. En chromatographie à phase normale, le constituant le moins polaire est
élué le premier ; l’augmentation de polarité de la phase mobile réduit son temps d’élution.
O O O
Si NH2 Si C N Si
O O O
Ce sont les supports les plus couramment utilisés, principalement avec un greffage alkyl
(octadécylsilane ou -ODS ou -C18). Dans ces systèmes, le solvant le plus polaire (l'eau) est
le moins éluant et la force éluante de la phase mobile est augmentée par ajout d'un solvant
organique (méthanol, acétonitrile), le constituant le plus polaire est élué le premier et
l’augmentation de polarité de la phase mobile allonge son temps d’élution.
O O
Si C8H17 Si C18H37
O O
Octyle Octadecyle
45
Chromatographie de Partage
L’éluant doit être immiscible à la phase stationnaire. La polarité de la phase mobile a une
grande influence sur le coefficient de partage des solutés, elle est constituée d’un mélange :
Eau/ solvant organique, en proportion variable.
La phase aqueuse : l’eau est le solvant le plus polaire
Le solvant organique : Il existe un grand nombre mais les plus employés sont l’acétonitrile
et le méthanol. Il est parfois intéressant de modifier la polarité de la phase mobile en lui
ajoutant, en mode normale, une substance plus polaire ou en mode inverse une substance
moins polaire.
Le pouvoir éluant croissant des solvants est le suivant:
Ether de pétrole cyclohéxane tétrachloroéthène trichloroéthane dichlorométhane
étherdiéthylique trichlorométhane éthanoate d’éthyle pyridine propanone éthanol
eau acide éthanoïque.
Applications
Exercices
Exercice 3.1
46
Chromatographie de Partage
Exercice 3.2
Exercice 3.3
La séparation suivante a été obtenue par CLHP Shimadzu LC 8A. Les conditions
opératoires sont les suivantes:
20
B C
mAU
3,669
10
1,984
A
4,011
8,672
47
Chromatographie de Partage
e) La sélectivité α de la séparation.
f) La résolution R de la séparation.
Exercice 3.4
A quels pics correspondent les composés suivants : benzène, éther diéthylique et n-hexane.
Les conditions expérimentales sont: la colonne a 4 mm de diamètre, 150 mm de long. Le
débit est de 1mL/min. La phase stationnaire C18 est constituée de greffons de chaînes
aliphatiques à 18 carbones. L’élution est faite par un mélange isocratique de méthanol
(60%) et d’eau (40%).
40 A
9,451
mAU
5,515
20 C
18,763
4,949
8,128
B
3,189
0 5 10 15 20
M inutes
48
Chromatographie d’Echange d’Ions
4.1. Définition
La chromatographie ionique (CI) est une technique analytique qui permet l’analyse
qualitative (par séparation des espèces présentes) et quantitative des espèces ioniques
présentes dans un échantillon liquide dépourvu de matières en suspension.
Un échangeur d’ions est une substance, généralement poreuse, sur laquelle est greffé (fixé),
par liaison covalente, un groupement chimique ionisable. Cette partie chargée peut interagir
fortement avec des ions présents dans le mélange chromatographié. Ainsi des molécules
chargées peuvent s’adsorber réversiblement sur l’échangeur d’ions, et être ensuite
désorbées de la résine, en modifiant la composition ionique du solvant. On peut résumer le
processus comme suit : dépôt des substances sur la colonne choisie en fonction des charges
des molécules et de la résine, élution des molécules généralement en augmentant de façon
graduelle la force ionique et enfin régénération de l’échangeur d’ions (par lavage avec une
solution de pH permettant de remettre les charges dans leur valeur initiale).
La phase stationnaire dans la chromatographie ionique est une résine (polymère insoluble
préparé sous formes de billes) échangeuse d’ions contenant des groupements chargés
positivement ou négativement permettant la rétention des espèces dont on désire obtenir la
séparation. Le soluté ionique ou ionisable interagit avec les groupes de charges opposées de
la phase stationnaire.
49
Chromatographie d’Echange d’Ions
L’échangeur d’ions comporte deux parties : Les groupements fonctionnels qui lui confèrent
ses propriétés et la matrice (support fixe) sur laquelle ces derniers sont greffés.
Les groupements fonctionnels sont fixés par des liaisons covalentes sur la matrice; ils sont
de deux types :
Ba+2> pb+2> Sr+2> Ca+2> Cd+2> Cu+2> Co+2> Zn+2> Mg+2> Tl+1> Ag+> Cs+> Rb+> K+>
NH4+> Na+> H+> Li+
L’acide carboxylique (G- = COO-) chargé à partir de pH 4,5 est un échangeur cationique
faible. Le groupement ammonium quaternaire -NR3+ est un échangeur anionique forts car
leur capacité d’échange est constante et indépendante du pH.
50
Chromatographie d’Echange d’Ions
Citrate> SO4-2> oxalate> I- > NO3- > Br- > SCN- > Cl- > formiate > acetate > OH- > F-
On utilise les échangeurs d'anions forts pour séparer des acides faibles (acides
carboxyliques) et les échangeurs faibles pour séparer des acides forts. Le même type de
raisonnement s'applique aux échangeurs de cations. En générale la résine préfère les ions
porteuses de la charge la plus grande et pour les ions de plus petite dimension. Le pH agit
sur la rétention, surtout pour des échangeurs anioniques ou cationiques faibles.
Exemple :
Les supports peuvent être de deux types: minéraux comme la silice et organiques comme la
résine polystyrénique, cellulose, dextrane
Porosité : le support est un polymère plus ou moins réticulé. La porosité dépend du taux de
pontage : un polymère très réticulé a des pores de petite taille et convient pour des petites
molécules.
Capacité de rétention : c'est la quantité maximale d'ions que peut fixer l'échangeur d'ions,
exprimée en mEq/g (milliéquivalent par gramme) de résine sèche ou en mEq/mL de poids
51
Chromatographie d’Echange d’Ions
La phase mobile est une solution aqueuse de force ionique donnée (généralement un
tampon de pH). On peut éluer avec une solution de composition constante (conditions
isocratiques) ou avec un gradient de pH et (ou) de force ionique, pour décrocher
successivement les différents ions fixés sur l'échangeur. Toutefois, il peut être nécessaire
d’utiliser des mélanges de solvants polaires (méthanol-eau) afin d’optimiser une élution ou
faciliter la solubilité de certain solutés. Le pH est paramètre principal de rétention. Pour un
acide faible, une augmentation de pH se traduit par :
AH A- + H+
52
Chromatographie d’Echange d’Ions
par un déplacement de l'équilibre vers la gauche, l'acide AH étant peu (ou pas) retenu.
Avec les acides aminés, on utilise une colonne échangeuse de cations (polystyrène
sulfoné). On se place initialement dans des conditions de pH (2) pour lesquelles tous les
acides aminés sont sous la forme
+
NH3-CH-COOH
R
Si on injecte sur la colonne des solutions tampon de pH croissant, les acides aminés seront
élués en fonction de leur pHi. En effet, quand le pH de la phase mobile est égal au pHi
l'acide aminé se trouve sous forme de switterion non chargé, donc non retenu.
+
NH3-CH-COO-
R
4.6. Détection
La détection par ampérométrie est appropriée pour les solutés, dont les produits d'oxydation
se déposent à la surface des électrodes de mesure. Il s'agit notamment d'hydrates de carbone
(sous forme ionique à des valeurs élevées de pH) ainsi que la plupart des composés sulfurés
comme les thiols. La détection photométrique concerne la plupart des acides et amines
aromatiques ou hétérocycliques comme l’acide benzoïque, l’aniline ainsi que les nitrates,
les iodures et sulfites.
53
Chromatographie d’Echange d’Ions
Phase mobile
Détecteur
Suppresseur Pompe
Pré-colonne
Injecteur
Applications
La chromatographie d'échange d'ions est utilisée pour séparer des molécules ionisables,
quelle que soit leur taille: ions minéraux (tous les cations alcalins, alcalino-terreux ou
métalliques), acides aminés, peptides, protéines, nucléotides, acides nucléiques, glucides
ionisés et lipides ionisés. C’est une méthode analytique de référence en analyse des eaux, et
est adaptée aux milieux biologiques.
54
Chromatographie d’Echange d’Ions
Exercices
Exercice 4.1
Quel est l’ordre d’élution des acides aminés? (On considérera que les interactions acide
aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatique).
Exercice 4.2
Un mélange de trois acides aminés : acide aspartique (pHi = 2,87), Arginine (pHi = 10,76)
et Leucine (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations.
L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6.
55
Chromatographie d’Exclusion
5. La chromatographie d'exclusion
5.1. Définition
Dans cette technique de chromatographie on utilise des granules de gels poreux, dont les pores
ont une taille voisine de celle des molécules des composés. La séparation résulte de la
différence de taille est fondée sur la possibilité de soluté à pénétrer ou de ne pas pénétrer à
l’intérieur des pores de la phase stationnaire (limite d’exclusion). Les molécules de
l’échantillon ; certains sont assez petites pour pénétrer dans la matrice poreuse, tandis que les
plus grandes restent dans le volume interstitiel de la phase stationnaire. Les solutés sont donc
élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires.
Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes de Sephadex sont totalement
exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes. Ils ont donc un
trajet plus court à parcourir pour arriver en bas de la colonne. Elles sortent les premières, à un
volume d'élution (VM ou Vo) appelé volume mort de la colonne.
Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes de Sephadex peuvent pénétrer
librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume
de liquide à l'intérieur des pores des billes plus volume de liquide à l'extérieur des billes ou
phase mobile). Les pores dans les billes du gel sont assez grands afin de permettre la
pénétration complète des petites molécules, mais ne laissent pas pénétrer toutes les molécules
à partir d’une certaine taille.
Les molécules de taille intermédiaire pénètrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille
et de leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont éluées
dans l'ordre des masses molaires décroissantes. Les molécules de masse molaire intermédiaire
sortent à des Ve intermédiaires et sont effectivement séparées.
56
Chromatographie d’Exclusion
Les phases stationnaires sont constituées par des polymères réticulés organiques ou minéraux,
sous forme de grains sphériques de 3 à 10 m de diamètre avec des pores compris entre 4 nm
et 200 nm et sous forme de billes ou de perles parfaitement calibrées. Mis en leur présence le
solvant pénètre à l’intérieur de chaque particule et provoque leur gonflement.
Dans cette technique le matériel servant de base est un gel. La filtration de gel est une
chromatographie d’exclusion sur un support hydrophile qui est utilisé pour séparer des espèces
polaires. Tandis que la perméation de gel est une chromatographie d’exclusion sur un support
qui est utilisée pour séparer des espèces non polaires.
Gels mous
Ce sont des structures faiblement réticulées et capables d’absorber dans leurs pores de grandes
quantités de solvant. Ils gonflent de plusieurs fois leurs volumes secs et leurs porosités
augmentent en proportion du volume du solvant absorbé.
57
Chromatographie d’Exclusion
O CH2
O
OH
OH O
OH n
Structure chimique de dextrane
Gels semi-rigides
Ils sont produits par polymérisation, ce sont des dérivés du vinylbenzène (DVB) en présence
d’agent réticulant. On les utilise principalement avec des solvants organiques.
Aérogels
Ce terme désigne ce terme des substances qui ne gonflent pas ; ce sont des gels de silice donc
des verres (poudre de verre très fine de granulométrie contrôlée et de porosité bien
déterminée). Ils ont évidemment des sites d’adsorption (groupements hydroxyles) qui peuvent
retarder excessivement les espèces polaires. On modifie alors chimiquement la silice.
Diamètre des pores : 10 à 150 nm.
58
Chromatographie d’Exclusion
Granule de gel
Elution avec le VM
La phase mobile doit surtout être capable de mouiller la phase stationnaire et d’éviter
l’adsorption. Lorsque le gel est mou, le solvant doit aussi le gonfler puisque la taille des pores
de ce gel dépend de la quantité de solvant imbibée. Les solvants les plus couramment utilisés
sont : Eau, chloroforme, trifluoroéthanol. Cette méthode chromatographique est pratiquement
indépendante de la nature du solvant donc on n’utilise pas de gradient d’élution puisqu’il n’y a
pas d’interaction soluté/phase mobile.
59
Chromatographie d’Exclusion
Le volume interstitiel ou volume mort VI (extérieur aux pores laissé libre entre les grains du
gel) et le volume VP le volume totale des pores.
VI : volume nécessaire pour transporter une grosse molécule
Ve= VI + VP est le volume de la phase mobile correspondant pour une petite molécule pouvant
rentrer dans tous les pores
Les volumes d’élution Ve = VI + KVP pour éluer les molécules de tailles intermédiaires
K représente le degré de pénétration d’une espèce présente dans un volume VP.
5.6. Détection
Le détecteur le plus employé est le réfractomètre différentiel ; d’autres détecteurs sont parfois
ajoutés au réfractomètre.
60
Chromatographie d’Exclusion
Exercices
Exercice 5.1
Comment peut-on séparer ces 4 polymères en une seule opération, sachant qu’on peut mettre
bout à bout deux colonnes?
61
Chromatographie d’Exclusion
Exercice 5.2
Quelle est la masse moyenne en poids d'une molécule dont le temps de perméation est de
6,4 min?
Exercice 5.3
Une colonne de filtration sur gel a un rayon r de 0,80 cm et une longueur l de 20 cm.
a) Calculer le volume de la colonne.
b) Le volume de la phase mobile en dehors des particules du gel est de 18,1 ml et le volume
total de la phase mobile est de 35,8 ml. Déterminer le coefficient K pour un soluté élué à 27,4
mL.
62
Chromatographie d’Affinité
6. La chromatographie d'affinité
6.1. Introduction
Affinité enzyme–substrat
Affinité ligand – récepteur
Affinité antigène-anticorps
Très souvent la molécule fixée sera sur le substrat, le ligand ou l’anticorps, ceci permettra
de purifier l’enzyme, le récepteur ou l’antigène, respectivement.
1) Etape de fixation
Un ligand biospécifique est fixé par liaison covalente à une matrice (dextrane, agarose) sans
perdre son affinité pour le produit à analyser. Le mélange de molécules contenant le
composé à purifier est chargé sur la colonne d’affinité. Seule la molécule présentant une
affinité pour la colonne sera retenue par l’effecteur greffé sur la phase stationnaire.
63
Chromatographie d’Affinité
2) Etape de purification
En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molécules contaminant
sont éliminées et éluées.
3) Etape d’élution
La molécule est finalement décrochée de la colonne et recueillie. Cette étape peut être
réalisée de différentes façons
Tampons de pH différent de celui ayant permis la charge donc changement de l’état
d’ionisation de la molécule donc on a désorption
Tampon de pH ionique différent de celle ayant permis la charge donc changement
de conformation de la molécule.
Compétition avec un ligand libre (libération de la molécule d'intérêt par compétition
pour les sites de fixation).
3 4
1 2
64
Chromatographie d’Affinité
La liaison d’une protéine P à un ligand L peut être représentée par cette équation :
kd
P + L P-L
kd’
P + L-M P-L-M
La liaison du ligand sur la matrice ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand.
Le kd’ devrait varier entre 10-4 M et 10-10 M.
La quantité de protéine retenue sur la colonne (P-L-M) dépendra:
1. du Kd’(l’interaction est trop faible si la valeur est supérieur à 10-4M)
2. de la concentration de protéine dans l’extrait
3. du degré de liaison du ligand à la matrice donc de la concentration de L-M
Le principe consiste à utiliser une phase stationnaire constituée d'un support (silice,
polymère) sur lequel a été greffée une molécule organique particulière qui présente une
affinité sélective pour certains constituants d'un mélange dont on cherche à les isoler. Ceux-
ci vont être sélectivement adsorbés ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les
autres composants sont très rapidement élués. Un changement de la phase mobile (pH,
force ionique ou ajout d'un compétiteur) permet ensuite d'éluer les substances intéressantes.
Le gel d’affinité est constitué d’un effecteur fixé par covalence à un support
(carboxyméthylcellulose, Sephadex, gel de polyacrylamide) par l’intermédiaire d’un bras
de fixation (espaceur), le plus souvent constitué d’une chaîne carbonée de longueur
variable.
65
Chromatographie d’Affinité
L'avantage de cette technique est sa très grande sélectivité potentielle, à tel point que son
utilisation peut parfois permettre une purification suffisante en une seule étape, ce qui est
rarement le cas avec les autres types de chromatographie.
Applications
La chromatographie d’affinité est utilisée pour purifier des produits présents dans ses
mélanges biologiques, purifier la forme active d'un produit de son dérivé inactif et séparer
des traces de molécules biologiques de grandes quantités d'impuretés.
66
CHAPITRE IV
Chapitre IV
I. Définition
En CPG la phase mobile est un gaz, ce fluide traverse une colonne renfermant des granulés
poreux qui constitue la phase stationnaire. Lorsque un échantillon à analyser est injecté et
vaporisé ; ces constituants sont entrainés à des vitesses inégales par la phase mobile, à la
sortie de la colonne se trouve un détecteur relié à un enregistreur. L’appareillage employé
pour effectuer la séparation est un chromatographe dont la figure 1 présente
schématiquement les principaux éléments.
67
Chromatographie en Phase Gazeuse
Micro
Injecteur Débitmètre
Diviseur de
flux Détecteur
(a)
Bonbonne
de gaz vecteur
Four
(b)
68
Chromatographie en Phase Gazeuse
L’élution est assurée par un flux de gaz inerte appelé gaz vecteur ou porteur (phase mobile).
Le gaz vecteur doit être pur, inerte (il ne doit pas réagir avec les constituants du mélange à
séparer) et le moins miscible possible avec la phase stationnaire. L’hélium est le gaz
porteur le plus courant, bien que l’on utilise aussi l’argon, l’azote et l’hydrogène. Le choix
du gaz vecteur est conditionné par l'efficacité de la séparation et la sensibilité du détecteur.
II.2. Injecteur
L'introduction du mélange se fait par l'intermédiaire d'une micro seringue dont le volume
varie généralement de 1 à 10 L et dont l’aiguille a un diamètre de l’ordre de 0,15 mm à
travers un diaphragme, ou septum, en élastomère dans une chambre à vaporisation
instantanée située au sommet de la colonne. La chambre d’injection est habituellement
69
Chromatographie en Phase Gazeuse
2. Injection « split/splitless »
Il s’agit d’injecteurs pouvant fonctionner suivant deux modes, avec ou sans division (encore
appelés split ou splitless).
En mode split, le gaz vecteur arrive avec un grand débit dans la chambre de vaporisation ;
une vanne de fuite sépare le courant gazeux en deux parties dont la plus petite est la seule à
pénétrer dans la colonne. Seulement 1% de l’échantillon injecté passe réellement sur la
colonne. L’autre partie (99%) s’échappe par un système de fuite. Ce mode est utilisé dans
le cas des colonnes capillaires à faible débit.
L’inconvénient de ce mode d’injection est l’évaporation sélective des composés les plus
volatils avec modification de la composition réelle de l’échantillon injecté.
Le mode splitless la solution injectée est volatilisé puis entraîner dans les premières spires
de la colonne capillaire où elle se condense. L’injecteur est ensuite balayé par le gaz
vecteur qui élimine l’excès de solvant. Ce procédé est réservé aux échantillons très dilués.
II.3. Four
Le four est une enceinte thermostatée dans laquelle se trouve la colonne possédant un
système de ventillation. Au lieu de maintenir la température constante on peut l’astreindre à
suivre une loi de variation donnée, généralement linéaire, pour obtenir une chromatographie à
température programmée.
70
Chromatographie en Phase Gazeuse
II.4. Colonne
Existant depuis les débuts de la CPG, elles sont faites avec des tubes spiralés le plus souvent
en acier ou plus rarement en verre, de diamètre intérieur de 2 à 6 mm, ont une longueur
comprise entre 1 et 3 m et sont enroulées sous forme hélicoïdale. Elles sont remplies d'un
support poreux, inerte et stable à température élevée, imprégné de 5 à 20% de phase
stationnaire (Fig.3 et 4).
Le support le plus utilisé est la terre de diatomées (silicates fossiles).
Support poreux
Tube
b) Colonne capillaire
Les colonnes capillaires ont un diamètre interne variant entre 0,05 et 0,35 mm et une
longueur comprise entre 10 et 50 m enroulés on spirale. Elles sont revêtues d’une couche de
polymère ou d’un film d’aluminium et sont enroulées sur un support métallique cylindrique
léger, en forme de cage. Il n'y a alors pas de remplissage: la phase stationnaire ou l'adsorbant
est déposée ou greffée sur la paroi interne de la colonne (sur la figure 5 on observe la phase
stationnaire déposée sur le métal). La faible quantité de phase stationnaire permet des
analyses rapides mais impose l'injection d'une quantité très faible d'échantillon 1g.
Revêtement de polyimide
Silice fondu
Phase stationnaire
c) Colonne semi-capillaire
Elles sont constituées d’un tube de silice de 0,53 mm de diamètre interne et ont une longueur
variant de 5 à 50 m. Elles remplacent, à l’heure actuelle, les colonnes à remplissage sur les
chromatographes anciens, tout en conservant les mêmes injecteurs et détecteurs. Elle supporte
l’injection d’une quantité plus grande d’échantillon qu’une colonne capillaire mais la
résolution est moins bonne (plus le diamètre d’une colonne est faible, meilleure est la
résolution). La colonne, enroulée sous forme hélicoïdale, est reliée à l'injecteur à l'une de ses
72
Chromatographie en Phase Gazeuse
Les phases stationnaires les plus courantes, classées par ordre de polarité croissante et leurs
noms commerciaux sont :
CH3
Si O
CH3
n
CH3
Si O
R
n
Le pourcentage donne dans chaque cas la fraction de groupements méthyle remplacés par le
groupement indiqué sur le squelette polysiloxanes. Pour le SE-52 le 5% polydiméthylphényl
73
Chromatographie en Phase Gazeuse
Phases polaires
Ce sont des dérivés de glycols, utilisés pour séparer les molécules de forte polarité
OV-275 (50 à 225°C), 100% cyanopropyl silicone
H2 H2
HO C C O H
Polyethylène glycol
Exemple
Un mélange d’heptane, propanol-1 et pentanol sont élués dans cet ordre lorsqu’on utilise
une phase stationnaire polaire telle que le Carbowax. Cet ordre est inversé quand on utilise
une phase stationnaire non polaire telle que le polydiméthyl siloxane.
74
Chromatographie en Phase Gazeuse
- Quelques définitions
Limite de détection (LD) : est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal
bruit au moins égal à 3.
Limite de quantification (LQ) : est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal
bruit au moins égal à 10.
Domaine de linéarité (LL) : domaine dans lequel la réponse du détecteur est directement
proportionnelle à la concentration.
Bonne sensibilité la sensibilité des détecteurs actuels sont comprises enter (10-8 et 10-15 g
soluté/s).
75
Chromatographie en Phase Gazeuse
C'est le détecteur le plus utilisé en CPG, il est spécifique aux composés carbonés sauf
HCHO et HCOOH. La phase mobile pénètre dans un petit brûleur dont la flamme est
alimentée par un mélange d’H2 et d’air. La combustion des composés organiques élués
produit des ions et des électrons qui sont collectés au moyen de deux électrodes. Le courant
très faible qui en résulte est transformé en une tension qui est enregistrée, le passage du
courant indique la présence d’un soluté. L’aire du pic obtenu est proportionnelle à la masse
et non à la concentration. L’avantage de ce détecteur est que les variations de débit de la
phase mobile ont peu d’influence sur la réponse et il présente l’inconvénient de détruire
l’échantillon au cours de l’étape de combustion.
Le spectromètre de masse est un des détecteurs les plus puissants pour la chromatographie
gazeuse. On appelle GC-MS (Gaz Chromatography-Mass Spectroscopy) la combinaison de
la chromatographie gazeuse et de la spectrométrie de masse. Un spectromètre de masse
mesure le rapport masse sur charge (m/z) des ions qui ont été produits à partir de
l’échantillon par une source d’ionisation qui est assez énergétique pour briser des liaisons
76
Chromatographie en Phase Gazeuse
chimiques dans les molécules de l’échantillon et forme beaucoup de fragments ; qui sont
très utiles pour identifier l’espèce moléculaire qui entre dans le spectromètre de masse à
partie du spectre de fragmentation ou par comparaison avec bibliothèque de spectre (Fig.2).
II.7.1. La température
Généralement, les composés les plus volatils sont les plus rapidement entraînés ; du fait leur
tension de vapeur plus élevée. Cependant, si la température de la colonne est trop élevée,
77
Chromatographie en Phase Gazeuse
l'équilibre des composants ne peut s'établir dans chaque phase et les pics apparaissent presque
tous en même temps. D’autre part, si la température est trop basse ; la vitesse est lente et la
diffusion importante et le temps de rétention devient trop long. Lorsque l'écart entre les points
d'ébullition des constituants du mélange à séparer est grand, il est souvent préférable
d'augmenter la température du four.
Le débit du gaz vecteur doit laisser le temps pour que les constituants du mélange puissent
s'équilibrer entre les deux phases mobile et stationnaire. Si le débit est trop rapide, la
séparation des pics est médiocre et s’il est trop lent, les pics perdent leur finesse par suite
d'une diffusion excessive des molécules dans le gaz vecteur. La courbe de Van Deemter
établie expérimentalement pour chaque colonne et chaque composé permet de définir la
valeur optimale de la vitesse de la phase mobile : uopt √
Quand le débit est bien réglé, on a intérêt à augmenter la température du four pour améliorer
la finesse des pics.
Le liquide qui constitue la phase stationnaire est, selon les cas, un hydrocarbure ramifié tel
que le squalane de polarité nulle, un polyalkylsiloxane peu polaire, un polyéther polaire ou un
polyester très polaire. La dissymétrie des pics ou les temps de rétention trop élevés sont le
reflet de phénomènes d’adsorption ou d’affinité trop importante des composés vis-à-vis la
phase stationnaire.
78
Chromatographie en Phase Gazeuse
La CPG permet d’analyser qualitativement des constituants d’un mélange en utilisant des
étalons ou témoins. Une substance pure au contact des phases, ne doit donner qu’un seul
pic sur le chromatogramme. Pour une même phase stationnaire et dans les mêmes
conditions opératoires, on ramène les grandeurs de rétention d’un composé quelconque à
celles d’un composé connu, l’étalon. Lorsque les grandeurs de rétention sont identiques,
cela nous permet de présumer de leur similitude ou d’affirmer leur non-identité en cas
contraire (la preuve que le composé en question est absent ou présent). La gamme d’étalons
est loin de couvrir tous les champs possibles des tensions de vapeurs.
79
Chromatographie en Phase Gazeuse
A) Indices de Kovats
L’identification d’une substance peut être facilitée par la connaissance de son indice de
Kovats qui pour une phase stationnaire déterminée repose sur la comparaison de son temps
de rétention et ceux de deux alcanes linéaires et ceci quelles que soient les conditions
opératoires.
Le pic du soluté i est encadré entre les pics de deux hydrocarbures normaux à n et n+1
atomes de carbone
On injecte sur la colonne à une température et à une pression d'entrée données, les alcanes
linéaires de formule CnH2n+2 avec n ≥ 5. On repère les temps de rétention réduits de ces
alcanes t'r(n) et t'r (n+1) et celui du produit considéré t'r(i)
Si un soluté est élué entre les deux alcanes (n) et (n+1), son indice de rétention Ii est donné
par la formule suivante: A chaque produit (i) est associé un indice de rétention I(i), cet
indice est basé sur un système d'étalonnage par des hydrocarbures linéaires.
En isotherme
() ( )
( )
( ) ( )
En programmation de température
() ( )
( )
( ) ( )
Les Avantages
80
Chromatographie en Phase Gazeuse
Transformer certains solutés par des réactifs chimiques dans la pré-colonne pour les rendre
facilement identifiables ou plus volatiles (dérivatisations, modification de structure).
Utiliser des adsorbants pour retenir certains constituants du mélange comme les acides gras,
les acides aminés et les alcools. Par exemple transformer les acides en esters, les alcools en
éthers ou éthers sillylés pour éviter la formation de liaison hydrogène et faciliter la
volatilisation du composé et éviter sa dégradation.
81
Chromatographie en Phase Gazeuse
MA=|concentration| A = KA SA
SA : surface du pic A
82
Chromatographie en Phase Gazeuse
a) La normalisation
mi = Ki Si
En considérant que tous les Ki sont égaux (série homologue d’alcanes, d’alcools, produit de
même squelette)
Cette méthode est utilisée dans le cas où la masse d’un constituant est en faible
concentration dans le mélange. Pour cela on concentre le composé en question pour avoir
une meilleure détection. On prend d’abord le chromatogramme du mélange de solutés à
étudier.
On pèse ensuite exactement une masse M de ce mélange voisine de 1g par exemple et qui
contient les masses mi des constituants. Puis on y rajoute une masse m0 du composé n°2,
connue exactement, voisine de 300 mg environ. Le chromatogramme du nouveau mélange
donne deux aires A1’ et A2’.
( )
83
Chromatographie en Phase Gazeuse
A2’ A1’
A2 A1
c) Etalonnage externe
La méthode la plus directe d’analyse quantitative par CPG consiste à préparer une série de
solutions étalons dont la composition est proche de la solution inconnu.
Injecter les solutions de la gamme étalon. Déterminer la surface de chaque pic des
différentes solutions. Tracer la courbe mA= f (SA) la fonction obtenu doit être une droite qui
passe par l’origine. Cette méthode permet de déterminer la masse ou la concentration du
composé dosé. Son inconvénient majeur est le volume d’injection qui doit être constant
dans la détermination de la courbe d’étalonnage et lors de l’injection de la solution à doser.
d) Etalonnage interne
La mise en œuvre de cette méthode nécessite un étalon interne que l’on doit ajouter à la
solution à analyser. Le volume injecté n’a aucune influence sur la détermination des
concentrations ou des masses. La seule difficulté de cette méthode réside dans le choix de
l’étalon interne. Cet étalon interne est un composé initialement absent de l’échantillon à
analyser qui a une structure et des propriétés physico-chimiques proches du composé dont
84
Chromatographie en Phase Gazeuse
on veut déterminer la concentration. Cette méthode est recommandée par l’analyse des
liquides
Préparer une solution, appelée solution étalon contenant: une masse connue du composé à
analyser et une masse connue d’étalon interne soit:
Ajouter à la solution à doser une masse connue d’étalon interne. Cette solution est appelée
X.
m AE K A S AE
m AE K A S AE et mEIE K EI S EIE .
mEIE K EI S EIE
KA
K A / EI est appelé facteur de réponse relatif
K EI
m AE S AX S EIE
et enfin : m AX E X E
m EIX
m EI S EI S A
85
Chromatographie en Phase Gazeuse
Applications
Exercices
Exercice 1
3HC
O
NH C N CH3
3HC CH3
Monuron
Exercice 2
86
Chromatographie en Phase Gazeuse
pour l’octane 6,8 min et pour la substance à étudier 4,7 minutes sur une colonne maintenue
en régime isotherme.
Déterminer l’indice de Kovats de cette substance.
Exercice 3
Un mélange de trois composés volatils A, B et C est analysé par CPG sur une colonne de
50 m de longueur. Les données concernant les temps de rétention, l’aire des pics ainsi que
les coefficients de réponse relatifs sont indiqués dans le tableau ci-dessous. Dans les mêmes
conditions, un composé non retenu par la phase stationnaire est élué avec un temps de 2,3
min. Calculer le pourcentage de chaque composé dans le mélange.
87
CHAPITRE V
Chapitre V
1. Introduction
La chromatographie par fluide supercritique (CFS) est utilisée pour la séparation des
composés thermolabiles et/ou de masses moléculaires élevées. Le matériel de conception
hybride entre CPG et CLHP. On peut utiliser soit les colonnes capillaires de la CPG soit les
colonnes classiques de CLHP. La CFS met en œuvre un fluide porté au-delà du point critique.
Les propriétés de ces phases mobiles supercritiques permettent à cette technique d’atteindre
entre autres de grandes efficacités par unité de temps, des sélectivités importantes et un
couplage possible avec les détecteurs de la CPG. La CFS peut être qualifiée de technique verte
de par son utilisation majoritaire du dioxyde de carbone.
3. Instrumentation
Les appareils de chromatographies par CFS ressemblent à ceux de la CLHP, pour assurer le
débit du fluide supercritique on utilise une pompe à piston. Le liquide passe ensuite dans un
serpentin chauffé pour élever sa température au-dessus du point critique afin de le transformer
en fluide supercritique. On utilise une grande variété de colonnes HPLC ou CPG et des
détecteurs UV ou par fluorescence. Contrairement à la CPL, la CFS autorise le couplage avec
le détecteur à ionisation de flamme (DIF) de la CPG, lorsque l'on est confronté à la séparation
88
Chromatographie en Phase Supercritique
d'un mélange complexe de solutés non volatils solubles dans le CO2 supercritique et non
aisément détectables (cas des hydrocarbures saturés des échantillons pétroliers), on peut donc
envisager de mettre en œuvre la CFS associée aux détecteurs de la CPG.
4. Phase mobile
Le dioxyde de carbone à l’état supercritique est le composé le plus utilisé parce que son point
critique a pour coordonnées TC = 31°C et Pc= 7 400 kPa (Fig.1). Si la pression et la
température sont toutes deux supérieures, on passe dans le domaine de l’état supercritique,
dans des conditions qui techniquement sont assez faciles d’accès. De plus ce composé est
atoxique, inflammable, transparent dans l’ultraviolet, inodore et non corrosif. En effet, le CO2
peut être facilement recyclé et purifié pour les applications à l'échelle préparatrice grosses
consommatrices de solvants.
30
25
20
Pression (Mpa)
phase phase
solide sub-critique 1
15 domaine
super-critique
10 point critique
point phase
5 triple liquide phase
phase sub-critique 2
gaz
Température (°C)
On utilise également :
le monoxyde de diazote N2O, TC= 36°C et Pc= 7 100 kPa
l’ammoniac NH3, TC= 132◦C, PC= 11 500 kPa.
Dans le cas des composés polaires difficiles à éluer par le CO2 pur, un modificateur polaire est
ajouté à la phase mobile en proportion modérés.
5. Phase stationnaire
90
Chromatographie en Phase Supercritique
Applications
Exercices
Exercice 1
Décrivez l’effet de la pression sur les chromatogrammes supercritiques.
Exercice 2
Quels sont les effets des modifications suivantes sur le temps d’élution en chromatographie en
phase supercritique ?
a) Augmentation du débit, à température et pression constantes.
b) Augmentation de la pression, à température et débit constant
c) Augmentation de la température, à pression et débit constants
Exercice 3
Quelles propriétés d’un fluide supercritique sont importantes en chromatographie ?
91
CHAPITRE VI
L’ÉCTROPHORÈSE CAPILAIRE
Electrophorèse Capillaire
Chapitre VI
Electrophorèse capillaire
1. Définition
92
Electrophorèse Capillaire
En électrophorèse, les constituants d’un mélange se séparent dans le temps par effet de
deux facteurs principaux appelés mobilité électrophorétique et flux ou écoulement électro-
osmotique, qui sont définissable pour les ions, les molécules, les particules.
Tout composé porteur d’une charge électrique se déplace dans un électrolyte supposé
immobile, vers l’électrode de signe opposé à une vitesse qui dépend des conditions de
l’expérience et de sa mobilité (migration) électrophorétique propre EP. Ce paramètre
accessible est défini à partir de la vitesse de migration électrophorétique du composé et du
champ électrique E:
⁄ ⁄ 1
L : longueur du capillaire
V : ddp appliquée entre les extrémités du capillaire
: vitesse de migration
: mobilité électrophorétique
93
Electrophorèse Capillaire
On affecte à la mobilité EP le signe (+) ou le signe (-) selon la nature de la charge portée.
Elle est nulle pour une espèce globale sans charge.
Le nombre de plateaux théoriques N dans une colonne d’électrophorèse capillaire est donné
par la relation :
2
Le second facteur qui contrôle la migration des solutés est l’écoulement de l’électrolyte
appelé flux électro-osmotique caractérisé par sa mobilité électro-osmotique définit EOS qui
apparait par effet de la paroi interne du capillaire. La paroi de la silice est en effet tapissé de
groupement silanols qui se déprotonnent si le pH est supérieur à 2 pour former une couche
polyanionique de type Si-O- :
Les cations présents dans la solution tampon vont se fixer sur les groupements silanols
chargés négativement pour former une couche fixe chargée positivement. Dès qu’un
champ électrique est appliqué, c’est cations sont attirés vers la cathode entraînant avec eux
le tampon créant ainsi le flux électro-osmotique. Ce déplacement de l’électrolyte produit
par la charge des ions et le potentiel appliqué, peut être contrôlé en modifiant la tension, le
pH, ou en introduisant des additifs.
Les molécules sont séparées de la façon suivante :
les cations migrent dans la meme direction que l'EOF,
les anions sont attirés vers 1'anode (+)
les neutres migrent à une vitesse intermédiaire entre celle des espèces anioniques et
celle des espèces cationiques
94
Electrophorèse Capillaire
cationiques et ne seront pas bien separ6es [27]. Plus le rapport masse/charge est eleve, plus
la vitcsse de migration electroosmotique est elevee en valeur
⁄ ⁄ 3
est déterminée à partir du temps de parcours que met un marqueur neutre pour
parcourir la distance effective du capillaire. On choisit une molécule organique, non
polaire au pH de l’électrolyte utilisé et facilement détectable par absorption dans l’UV.
⁄ 4
3. Mobilité apparente
En fonction de ce qui précède, chaque ion a donc une vitesse apparente de migration app
qui dépend de la vitesse électrophorétique et de la vitesse du flux électro-osmotique :
⁄ 6
95
Electrophorèse Capillaire
⁄ ⁄ 7
⁄ ( ) 8
9
4. Modes d’injection
Pour introduire un micro volume d’échantillon, qui ne doit pas dépasser 1 % de la longueur
utile du capillaire deux procédés sont utilisés :
➤ L’injection hydrostatique
Elle consiste à plonger l’extrémité du capillaire dans l’échantillon en solution (également
un électrolyte) et à provoquer une aspiration à l’autre extrémité.
5. Modes de détection
Détection UV/VIS
Détection par fluorescence
Détection électrochimique. Réalisable en insérant de minuscules électrodes dans le
capillaire
Détection par spectrométrie de masse
96
Electrophorèse Capillaire
Applications
L’électrophorèse capillaire est utilisée dans la séparation des protéines et des acides
nucléiques biochimies et biologie moléculaire. Elle est comparable à la chromatographie
liquide quant aux performances, elle complète utilement cette dernière pour les séparations
de protéines, d'enzymes, de sucres et d'oligonucléotides. La sensibilité est très grande. La
quantité requise d'échantillon est très faible et la consommation de réactifs ou de solvants
est négligeable.
Exercices
Exercice 1
97
Corrections des Exercices
Chapitre I
Exercice 1
=1,2
Exercice 2
2037 cm/s
Exercice 3
Exercice 4
a) uopt= 12 cm.s-1
b) Hmin = 0,025 cm
Exercice 5
Chapitre II
Exercice 1.1
Non, le bleu patenté contient le jaune tartrazine
Exercice 2.1
Rf (A)= 0,9
Rf (B)= 0,28
Exercice 2.2
Les encres B et C sont pures, l’encre A est un mélange
Rf = 0,8
Exercice 2.3
a) RfA = 0,5 ; NA = 6834 ; HA=0,004 mm
RfB = 0,4 ; NB = 2235 ; HB= 0,011 mm
b) R= 2,7
98
Corrections des Exercices
Exercice 2.4
a) Non, A un mélange
b) Le composé un contient le menthol
Chapitre III
Exercice 1.1
Exercice 1.2
1. R= 0,84
2. Nmoy = 1609
3. H= 0,15 mm
4. L2 = 80 cm
5. trB = 20,99 min
Exercice 3.1
1. Phase inverse (eau solvant polaire, phase mobile polaire donc la phase
stationnaire doit être apolaire)
2. L’ordre d’élution : penta-1,2-diol, penta-1-ol, pent-1-ène et le pentane
Exercice 3.2
Une phase stationnaire C18
Exercice 3.3
1) La phase stationnaire apolaire (groupement C18)
La phase mobile polaire
2) a) NA = 46611 ; NB = 330 ; NC = 1120
b) Nmoy = 16022
c) Vm = 1,984 mL
d) k’A =0,849 ; k’B = 1,021 et k’C =3,370
e) A-B =1,2 ; B-C =3,3
f) RA-B =0,71 ; RB-C = 4,8
g) PRA-B =0,38 ; PRB-C = 4,5
h) trC = 9,5 min
99
Corrections des Exercices
Exercice 3.4
A : éther diéthylique
B : benzène
C : n-hexane.
Exercice 4.1
A pH=2, les acides aminés sont chargés positivement, retenus sur la résine.
Exercice 4.2
Exercice 5.1
MM= 5000 Da
Exercice 5.2
En mettant bout à bout les colonnes C et A les quatre étalons de polystyrène seront
séparés : on obtiendra donc 4 pics distincts.
Exercice 5.3
a) Vt=40,2 mL
b) K=0,52
Chapitre IV
Exercice 1
[monuron]= 8,36 mg/L
Exercice 2
Ii =644
100
Corrections des Exercices
Exercice 3
% (A) = 12,45
% (B) = 25,63
% (C) = 61,92
Chapitre V
Exercice 1
Exercice 2
a) diminution du tr
b) diminution du tr
c) augmentation du tr
Exercice 3
Chapitre VI
Exercice 1
101
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Références Bibliographiques
Références
h-boucheloukhh@univ_jijel.dz
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