culture

in vitro
végétale
I- ORGANISATION

ET PROPRIÉTÉS

DE LA CELLULE
A) ORGANISATION
La cellule (du latin cellula petite chambre) est
l'unité structurale, fonctionnelle et
reproductrice constituant tout ou partie
d'un être vivant (à l'exception des virus).

elle est donc l’unité de base des êtres

vivants.

Les cellules de même type sont réunies en

tissus, eux-mêmes réunis en organes.
Il existe deux grands groupes de cellules : les
cellules procaryotes ou bactéries qui ne
possèdent pas de noyau et les cellules
eucaryotes qui possèdent un noyau

Chez les eucaryotes (végétaux et animaux), la

structure générale et le fonctionnement global
de la cellule sont communs.
Cependant, cellule animale et cellule végétale
se distinguent par quelques caractères qui ont
des implications importantes sur la structure et
le fonctionnement de l'organisme entier.
 Centrosome Paroi Plaste
Centrosome

vacuole
 CELLULES VÉGÉTALES

Elles comprennent généralement un

noyau cellulaire entouré d'un
cytoplasme, divers organites ou
plastes, le tout étant protégé par une
membrane cellulaire.
 cytoplasme
cytoplasme

membrane

Ultrastructure d’une cellule végétale

 plasmodesme

noyau
membrane cellulaire

paroi cellulaire

cytoplasme
plaste

Structure d’une cellule végétale

 Les principaux caractères distinctifs :
- une grande vacuole

- une paroi pectocellulosique

- les plastes

- les plasmodesmes, reliant les pores de la

paroi cellulaire, ce qui permet à chaque
cellule végétale de communiquer avec les
cellules adjacentes.
 - La vacuole : elle représente un espace très
important dans la plupart des cellules végétales.
Elle est entourée d'une membrane, le tonoplaste
et contient une solution. Qui peut jouer un rôle de
détoxification ou de réserve ou contribuer à la
régulation de l'équilibre hydrique de la cellule
- La paroi cellulaire : elle constitue un des
éléments essentiels de la cellule végétale. La
paroi est le lieu des échanges intercellulaires.
Elle donne à la cellule sa forme et ses
caractéristiques structurales. Elle permet
également sa croissance. Au cours du
développement du végétal, elle participe à la
différenciation cellulaire et permet aux cellules
de privilégier certaines fonctions.
- Les plastes : ils sont des organites semi-
autonomes qui possèdent un matériel génétique
(ADN plastidial) et la machinerie nécessaire à la
synthèse de protéines (ribosomes). Il en existe
plusieurs sortes dont les deux principaux sont
les chloroplastes et les amyloplastes.
B) PROPRIÉTÉS
- La régulation du métabolisme
Toute cellule, qu'elle soit autonome ou qu'elle fasse partie
d'un organisme multicellulaire, capte, enregistre et traite
une grande masse d'informations. La cellule possède de
nombreux récepteurs – des protéines exprimées à sa
surface membranaire – qui lui permettent de détecter ces
informations extracellulaires.

- La division
La capacité à croître et à se multiplier est une propriété
fondamentale du monde vivant dont la cellule est l'unité de
base. Le processus de multiplication procède par divisions
cellulaires successives.

- La totipotence
Capacité qu’ont les cellules à se différencier en n’importe
quelle cellule spécialisée et de se structurer en formant un
être vivant multicellulaire.
Toute cellule végétale, quelle que soit sa
«spécialisation», du moment qu'elle est vivante et
possède un noyau, est capable de reproduire la
plante entière d'où elle provient.
C'est à cette remarquable propriété de la cellule
végétale d'être «totipotentielle», c'est-à-dire
capable d'évoluer dans toute sorte de direction que
la culture in vitro doit toute son extension.

Cette propriété repose sur l'aptitude à la

dédifférenciation : les cellules peuvent redevenir
des cellules simples, non spécialisées et se
différencier ensuite pour donner à nouveau les
différents types de cellules spécialisées.
La démonstration de la totipotence nécessite:
la multiplication d’une cellule unique
Sa transformation en un organisme complet

A
inflorescence microspore embryon

Plante acclimaté
en pot vitroplant plantules
II- PRINCIPES DE BASE DE
LA CULTURE IN VITRO
 Définition de la culture in vitro

On appelle techniques in vitro un corpus

de méthodes faisant intervenir d’une part

des éléments d’aseptie et d’autre part

impliquant la mise en place d’un

environnement parfaitement contrôlé.

Les biotechnologies végétales reposent
principalement sur les cultures in vitro.

Les premiers résultats intéressants de

culture de tissus végétaux furent obtenus
par Gautheret, Nobecourt et White en 1938.
Les techniques de culture in vitro végétales
utilisent la propriété de totipotence des
cellules végétales mise en évidence en 1902
par Haberlandt : “toute cellule végétale est capable
de se dédifférencier et de régénérer un autre individu
identique à celui dont elle est issue”

Cette propriété s'exprime dans la nature et

est exploitée depuis la nuit des temps dans
les phénomènes de bouturage, drageonnage,
marcottage etc.
La CIV se fait hors sol, en conditions stériles et
très contrôlées, dans des flacons ou tubes
fermés, sur des milieux synthétiques solides ou
liquides, contenant des sels minéraux, une
source énergétique et des adjuvants.

CONCLUSION
 La culture in vitro est la culture d’explants, sur
un milieu synthétique, dans des conditions
stériles, dans un environnement contrôlé et dans
un espace réduit.
Conditions naturelles Culture in vitro
- Les explants peuvent être des parties
d'organes ou des organes entiers, (tige,
feuille, racine, fleurs, etc.), des tissus, des
pièces florales, des graines ou des embryons,
des bourgeons ou des apex ou des
méristèmes, des cellules somatiques ou
sexuelles, des protoplastes.

- Le choix de l'explant sera fonction de la

technique utilisée, de l'objectif et de l'espèce
travaillée.
- Le milieu synthétique est adapté dans sa
composition à la technique, l'explant, l'objectif
et l'espèce, voire le cultivar.

Il est en général composé d'eau, de macro et de

micro-éléments (sels minéraux), de substances
de croissance : phytohormones et vitamines, de
sucre et d'un agent gélifiant pour les milieux
solides.

Le milieu neuf toutes les 3 ou 4 semaines en

général.
- Les conditions stériles sont obtenues par une

désinfection des explants, une stérilisation du

milieu de culture et des flacons ou tubes de

culture. Les différentes opérations de mise en

culture sont réalisées dans un environnement

stérile obtenu par une HOTTE À FLUX LAMINAIRE

: de l'air stérile est propulsé vers le vitroculteur.

 DISPOSER D’UN AUTOCLAVE POUR

STÉRILISER LE MATÉRIEL DE CULTURE

Hotte à flux laminaire
Autoclave
- L'environnement contrôlé concerne notamment deux
paramètres : la température de culture, et
l’éclairement : intensité et longueur du jour. Ils sont
obtenus artificiellement.
Leurs valeurs dépendent de l'espèce travaillée ainsi
que de la technique utilisée.

- L'espace est réduit car les plantes sont

miniaturisées, cultivées dans des récipients tenant
sur des étagères éclairées, ce qui permet d'avoir la
possibilité de replanter des hectares de terrain à
partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés.
Les techniques de culture in vitro cherchent à
contrôler les facteurs de l’environnement
(température, lumière, composition du milieu…)
du fragment de plante mis en culture afin de
l’orienter vers un programme d’évolution
déterminé.
 III- LES CONDITIONS
REQUISES EN CULTURE
IN VITRO
 1- CONDITIONS D’HYGIÈNE
Exigences de la culture in vitro :
A - la propreté de la verrerie et du matériel de
culture ainsi que leur stérilisation adéquate

- le matériel de culture doit être autoclavable ou

stérile
- Il est conseillé de laver cette verrerie avec une
préparation de savon, de rincer abondamment avec
l’eau puis de l’eau désionisée et de sécher à sec
- le matériel de culture, s’il doit être stockée, doit
l’être à l’abri de la poussière ou le cas échéant
emballé dans du papier ou dans des feuilles en
aluminium
NB: le matériel de culture en plastique
B- La qualité constante et contrôlée dans la
préparation des milieux de culture et leur
stérilisation

Le personnel chargé de la préparation des

milieux doit être de toute confiance
- Les locaux de préparation et de stockage
maintenus dans un état de propreté maximum
- Disposer d’une balance de précision (10-4 à 10-1 g environ)

- Les solutions mères et les phytohormones

doivent être préalablement préparées
- Le pH sera ajusté à 5,8 au pH-mètre en ayant
soin de placer sur un agitateur magnétique
- Stérilisation à l’autoclave à 121°C pendant 30min
sous 1 bar
 C- La parfaite disposition des zones de
transfert aseptique et de zone de culture

- L’initiation des cultures et leur transfert doit se faire dans

une zone protégée qui est une hotte à flux laminaire
horizontal ou vertical

- La salle de culture doit être à coté de la zone de transfert

- La salle doit être climatisée, équipée d’un système de

contrôle de la température, d’un éclairage avec alternance
lumière/obscurité (500-5000 lux ou 0,2-2 W/m²

- Connaître les conditions de température et d’éclairement

favorable au développement des cultures

- La hotte doit être nettoyé a l’eau de javel pure ou alcool pure

Hotte à flux laminaire
 D- l’hygiène corporelle

- Se nettoyer les mains avant et après les

manipulations : On peut employer une solution à 1°/°°
de Cetavlon de Mercryl laurylé ou de Biocidan ou des
savons additionnés d'antiseptiques ou simplement de
l’alcool à 70%

- Porter des vêtements propres pour éviter toute

contamination (blouse propre, gants, masque)

- Utiliser des chaussures propres, disposées en

l’entrée de la salle de culture pour entrer dans la dite
salle
2- PRÉPARATION ET STÉRILISATION
DU MATÉRIEL VÉGÉTAL
 - Le prélèvement des tissus doit se faire sur
des zones saines (sans blessure ni lésions) et sur
les plantes vigoureux. Il doit être débarrassé des
premiers téguments ou gaines foliaire lavé
abondamment à l’eau de robinet avant de passer
à la stérilisation

- La méthode de désinfection la plus rependue

consiste à immerger brièvement les le tissus
dans l’éthanol ou isopropanol à 70% avant de
passer dans l’agent stérilisant. L’ajout, dans ces
solutions, de deux à trois goûtes de détergent
(Tween 20) est recommandé
 La stérilisation consiste à désinfecter les
explants afin de les rendre stériles, avant de les
placer sur un milieu de culture approprié.

- L’hypochlorite de sodium (1 - 3,6%) et de

calcium (5 - 7%) sont les désinfectants les plus
utilisés comme désinfectants.

- Dans les cas de contaminations fongiques

importantes, le chlorure de mercure (0,1 - 0,3%)
est utilisé.
 - Dans les cas difficiles où l’on ne peut
absolument éliminer les contaminations
bactériennes, il est conseillé d’ajouter au milieu
de culture un ou plusieurs antibiotiques
(pénicilline à 100 µg/ml ; rifampicine à 20 µg/ml).

- Tenir compte de la nature de l'explant pour la

durée de la stérilisation (5; 10; 15; 20; 25; 30 min).

- Après passage dans l’agent stérilisant, les

explants sont rincés à l'eau stérile (2-3 fois).
L’intervalle de temps entre deux rinçages
successifs est de 5 minutes au moins.
Disposition du plan de travail

Mise en culture d’un fragment de feuille:

à réaliser avec le plus grand soin
IV- MILIEUX DE CULTURE
 L’explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin
pour survivre, se multiplier et régénérer un nouvel individu. Pour cela, il
doit y trouver tout ce que la plante fournie en conditions naturelles.

Conditions naturelles Conditions in vitro

Substances organiques
Sucres - Acides Aminés - Vitamines

Régulateurs de Croissance: Hormones

Auxines – Cytokinines – Gibbérellines …

Eau+ Eléments Minéraux

Macro-Eléments : N, P, K, Ca, Mg, S
Micro-Eléments : Fe, Zn, B, Mn, Ca, Co,
Ni, Al, Mo, I

Substances non identifiées

-Extrait de Levure
-Lait de Coco
-Extrait de Plantes
-Hydrolysat de Caséine
-Peptone et Tryptone
- Il existe une multitude de milieux de culture.
Ceux-ci doivent fournir à la plante tous les
éléments nutritifs dont elle a besoin.

- On distingue deux types de milieux:

 ceux ayant une consistance liquide et servant

aux cultures de cellules

 ceux 'solides', ayant la consistance d'un flan,

servant aux cultures de tissus, cals, bourgeons,
racines
Milieu solide Milieu liquide
 Parmi les milieux de culture, on peut
citer : le milieu de Murashige & Skoog (MS),
Gamborg (B5), Nitsch, Shenk &
Hilderbrandt (SH), etc.

 COMPOSITION DU MILIEU DE CULTURE

- MACROÉLÉMENTS (Nitrate et/ou Ammonium, Calcium, Magnésium, Phosphate, Fer)

- MICROÉLÉMENTS (cuivre, manganèse, cobalt, nickel, iode, zinc, bore)

- VITAMINES
- PHYTOHORMONES : auxines et cytokinines

- SUCRE (glucose ou saccharose) : 3 à 4 %

- GÉLOSE (agar-agar: dose de 0,6 - 0,9 % ou gelrite: 0,2 - 0,3%)

 Parmi ces milieux de
base MS est le plus utilisé
 Le milieu gélosé est porté à ébullition, le pH est
ajusté à 5,8 avec du HCl ou du NaOH (0,1N) avant
d’être autoclavé à la pression d’une bar à 121°C
pendant 20 à 30 min.

A - Préparation des solutions-mères

Pour éviter de peser les différents produits pour
chaque expérience on prépare des solutions
concentrées des diverses substances entrant dans
la composition des milieux de culture
On effectue ensuite les dilutions adéquates
Les solutions concentrées sont appelées solutions-
mères
La préparation se fait dans des fioles Jaugées,
avec beaucoup de précision
PRINCIPE :

 Si on doit avoir une concentration de CaCl2, 2H2O

de 15 mg/l et de KH2PO4 de 10 mg/l dans le milieu de
culture
 et si on prépare une solution mère contenant
15 x 100 mg/l de CaCl2, 2H2O et 10 x 100 mg/l de
KH2PO4 on dira que cette solution-mère est
concentrée 100 fois plus que le milieu final (x100)

 Pour apporter 15 mg de CaCl2, 2H2O et 10 mg de

KH2PO4 dans un litre de milieu de culture on
effectuera la dilution suivante : 10 ml de cette
solution-mère dans une fiole jaugée de 1 litre.
 1- Solution-mère de macroéléments (x 20) : 1000 ml
Peser et dissoudre les différents sels dans l'ordre
indiqué avec un peu d'eau distillée. N'ajouter le sel suivant
qu'après totale dilution du précédent. Le tout se dissout à
froid.

2- Solution de Na2-EDTA et FeSO4 (x200) : 100 ml

Dissoudre l'EDTA (Acide éthylènediaminetétracétique
sel disodique) au bain-marie chaud.
Puis, ajouter le sulfate de fer.

3- Solution de microéléments (x 1000) : 100 ml

Dissoudre chaque sel dans l'ordre, au bain-marie chaud.
Pour le Cu et le Co peser 10 mg de chaque sel et les
dissoudre chacun dans 10 ml d'eau distillée. Prélever 2,5
ml de chaque solution et les ajouter aux autres sels dans la
fiole jaugée de 1 litre.
4- Solution-mère de vitamines (x 1000) : 50 ml
(Mélange)

5- Solution-mère des hormones

AUXINE : Acide 2,4 diphénoxyacétique (2,4-D)
ANA - AIB

CYTOKININE: Kinétine
BAP - Zéatine - TDZ
 Dissoudre chacun dans 2 ml de méthanol,
compléter à l'eau distillée
 LE RAPPORT AUXINES / CYTOKININES
DÉTERMINE LE DEVENIR DES TISSUS EN CULTURE

Notion de balance hormonale

1)En concentrations égales->division de cellules

indifférenciées

2) Auxine -> formation de racines

3) Cytokinines -> bourgeons

 10mg/l
Régénération de bourgeons 0 embryogenèse somatique

bouturage

Rhizogenèse sur cal

callogenèse

0 10mg/l

10mg/l
EXEMPLE
B - Préparation du milieu de culture
Elle se fait dans des fioles jaugées.

Exemple : Pour le cotonnier (Gossypium hirsutum)

Préparer un litre d'une solution de "M.S." à partir des

solutions-mères en réalisant les dilutions adéquates :

- solution-mère de macroéléments ................. ml

................. ml
- solution-mère de Na2-EDTA-FeSO4-

................. ml
- solution-mère de microéléments

................. ml
- solution-mère de vitamines
- eau distillée q.s.p. 1000 ml
 La solution est mise dans un erlenmeyer. On ajoute à ce
milieu du saccharose à la dose de 3 % Donc, pour 500 ml
de solution il faudra peser ........ g de saccharose

 Placer l'erlenmeyer au bain-marie bouillant. Au bout de

quelques minutes, ajouter l’agar agar en pluie fine en
brassant le milieu avec un agitateur de verre jusqu’à sa
dissolution

 On mesure le pH de la solution, au pH-mètre, en ayant soin

de placer un agitateur magnétique. Le pH est ajusté à 5,8

 Ne pas oublier de mettre des étiquettes sur chaque

portoir (milieu, hormones, date de préparation)

La stérilisation est faite à l'autoclave en phase vapeur, à

121°C pendant 30 minutes sous une pression de 1 bar
 V- MICROPROPAGATION

Et tous plus
beaux que
J’aurai un
moi !
million de
descendants
en 1 an !
 Les plantes se reproduisent par
la voie sexuée via les graines,
mais elles utilisent pour certaines
végétales une autre voie, celle de
la multiplication végétative.
 La particularité de cette reproduction
est que les plantes filles qui en sont
issues sont identiques génétiquement à la
plante mère: c'est le clonage végétal ou
multiplication conforme qui est exploitée
depuis des siècles par les horticulteurs et
jardiniers : bouturage, marcottage,
greffage etc.
 La multiplication végétative in vitro apporte un
progrès considérable par rapport aux méthodes
traditionnelles, avec un taux de multiplication de
100 à 1000 fois plus élevé.

 Grâce à cette technique, on part d’une petite

quantité de tissu au départ pour produire une
infinité de plantes identiques à celle du départ

 On peut constituer des collections de pieds-

mères, des banques de clones, faire de la
sauvegarde d’espèces en voie d’extinction,
programmer des cultures tout au long de l’année,
ect.
 LA MICROPROPAGATION
COMPREND 4 PHASES :

1- Etablissement de la culture aseptique

2- Multiplication : on cherche le maximum

d’unités de propagation dans le minimum de
temps. Le taux de multiplication moyen est de
l’ordre de 200000/an à partir d’une bouture.
Dans le milieu, il faut favoriser les cytokinines
pour la multiplication cellulaire. La balance
hormonale endogène de la plante mère est
aussi important (choix de l’explant)
3- Enracinement : étape la plus
délicate. On cherche à différencier des
initiaux racinaires et provoquer leur
développement

4- Acclimatation en serre (10 à 60

jours). On cherche à maintenir une
humidité très élevée au début. On
réduit ensuite progressivement
l’humidité ambiante
 1- MULTIPLICATION PAR BOURGEONNEMENT AXILLAIRE

 Les organes utilisés concernent généralement les

explants prélevés à la base des feuilles ou des gaines
foliaires et sur le bourgeon terminal des plantes.

 La composition du milieu peut être contrôlée de

telle manière que tous les bourgeons axillaires
potentiellement présents puissent se développer en
autant de petites tiges et celles-ci à leur tour
peuvent développer des rameaux.
 Le même développement végétatif peut être
provoqué à partir des tiges ou d’inflorescences
pourvu qu’ils comportent des nœuds et par
conséquent des bourgeons axillaires.
Multiplication par bourgeonnement axillaire
 2- MULTIPLICATION PAR BOURGEONNEMENT ADVENTIF

 L’initiation des bourgeons peut être en principe

induite sur n’importe quel type d’organe ou de tissu y
compris ceux qui ne les produisent pas dans les
conditions naturelles.
 La multiplication adventive peut survenir sur un
fragment d’organe, une portion de tissu ou même des
cellules isolées telles que les graines de pollen, les
protoplasmes.
 Les bourgeons se développent en tige sur le milieu
d’allongement.

 Dans certains cas, les cellules de l’explant initial

se divisent rapidement pour former de manière
désorganisée des cals. Ces cals subcultivés sur
milieu solide d’accroissement puis sur milieu
d’induction approprié donne des bourgeons.
Multiplication par bourgeonnement adventif
BANANIER

méristème
COTONNIER
ANANAS
ANANAS

néoformation de bourgeons
EXEMPLE 3 : Jatropha
VI- CULTURE DE MERISTEMES
Les méristèmes sont formés de cellules non
différenciées, à l'origine de tous les tissus de
la plante.

La culture des méristèmes permet d'obtenir

une plante identique à la plante initiale.

L'intérêt des méristèmes réside dans le fait

que ce sont des structures indemnes de virus.

Leur culture donne des plantes saines

La culture de méristèmes permet le
sauvetage des variétés menacées de
disparition car très virosées.

Elle concerne essentiellement les plantes

à reproduction par voie végétative:
bouturage, marcottage, etc. tels la pomme
de terre, le manioc, etc. car cette voie
favorise la transmission des virus à la
descendance.
Les plantes produites sont saines:
sans virus, champignons et bactéries et
répondent aux normes phytosanitaires
d'échanges internationaux de plus en plus
draconiennes.

Les plantes assainies ont une vigueur accrue, et

des qualités de floraison et de fructification
restaurées.

On obtient des variétés conformes à la variété

d'origine et que l'on peut multiplier en grande
quantité, la production est homogène.
VII- CULTURE D’ANTHERE
Les plantes haploïdes sont issues d'une cellule
sexuelle mâle ou d'une cellule sexuelle femelle
sans fécondation.

Les plantes obtenues n'ont qu'un seul lot de

chromosomes au lieu de 2 normalement, qui est
doublé naturellement ou artificiellement afin
qu'elles deviennent fertiles.

Elles peuvent être obtenues par androgenèse,

par gynogenèse, par fécondation avec du pollen
irradié ou par croisements interspécifiques.
L' ANDROGENESE ou les plantes "sans mère"

Technique
C'est la régénération de plantes entières à partir
de culture de cellules sexuelles mâles: des
grains de pollen immatures, soit par culture de
pollen isolé, soit par culture d'anthères.

Objectif
Obtenir des plantes haploïdes doublées, (après
doublement spontané ou artificiel par
colchicine). Ainsi des lignées pures sont
produites en quelques mois au lieu de 8 à 10 ans
par technique classique d'autofécondations.
L'obtention de lignées pures est une étape
presque toujours nécessaire des programmes
d'amélioration des plantes.
Applications
C'est une technique utilisée chez le blé, le riz, la
pomme de terre, le tabac, le maïs, le piment,
l'aubergine, etc..

Avantages
Cette technique amène un important gain de temps,
ce qui permet de mettre plus rapidement sur le
marché de nouvelles variétés présentant des
avantages pour l'agriculteur, l'industriel ou le
consommateur.
En effet une plante homozygote est directement
obtenue, ce qui évite de faire une dizaine de
générations d'autofécondations pour obtenir une
lignée pure, état nécessaire aux programmes de
sélection végétale.
exemple: androgenèse chez le Blé

Culture des anthères, puis au bout de 1 à 2 mois les embryons androgénétiques sortent des anthères

Les embryons sont repiqués et forment des plantules, certaines sont albinos
 Les plantules sont acclimatées après doublement artificiel du
nombre de chromosomes avec de la colchicine. Puis les plantes
haploïdes doublées sont cultivées en plein champ
 androgenèse: autres exemples

Embryons émergeant de l’anthère

Rice haploïd production<

Allium cepa haploïd production
LES APPLICATIONS DE LA CULTURE IN VITRO

Culture
d’anthère

Haplodiploïdisation

Culture
d’embryons

Micropropagation

Cryoconservation

Production de
métabolites
secondaires