Analyses Biochimiques Médicales
Analyses Biochimiques Médicales
: Biochimie Appliquée
Semestre : S1
Intitulé de l’UE : UED11: Découverte (Obligatoire)
Intitulé de la matière : UED111 : Analyses Biochimiques Médicales ANBM-MB17
Crédits : 2
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Introduction
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La chimie des urines puis du sang et des tumeurs a été
pendant longtemps la seule discipline de la « biologie
médicale ».
L'hématologie, l’histologie, la microbiologie,
l'immunologie se sont ensuite fortement développées et
se regroupent souvent maintenant au côté de la
biochimie, dans le cadre moderne de la biologie
moléculaire.
La biochimie clinique associe la chimie physiologique,
la chimie séméiologique et la biologie moléculaire.
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Éléments d'organisation
du laboratoire
• L'examen biologique n'est pas seulement une analyse, mais
représente un ensemble complexe d'étapes qui, du
prélèvement au compte rendu final, nécessite une surveillance
permanente. Les résultats devront en effet être aussi exacts que
les techniques modernes le permettent.
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(b) La deuxième, analytique, est l'étape technique proprement
dite avec tous les éléments du traitement de l'échantillon.
(c) La troisième étape, post-analytique, consiste à valider les
résultats bruts, à les analyser dans leur cohérence et à les
présenter dans une forme permettant une bonne interprétation
par le prescripteur.
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A. Prélèvement
La procédure de recueil du prélèvement devra tenir compte de
trois types de paramètres
Sujet Etat physiologique •Age, sexe, taille, poids
•Jeune , stresse, activité
physique, régime, tabac
•Grossesse lactation,
ménopause
Position • debout
•couché
Rythme • circadien
• hebdomadaire
• mensuel
constituant Métabolisme in vitro,
dégradation
Sensibilité aux agents • lumière,
extérieurs •Variation de température
effecteurs • analogues structuraux
• médicaments
Spécimen Plasma/ sérum
Urine 6
Liquide céphalorachidien
• Paramètres liés au sujet
Si un jeûne de 12 heures est impératif pour un bilan lipidique,
la glycémie et la phosphatémie, un jeûne de 3 heures est
suffisant pour la majorité des autres paramètres.
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• Paramètres liés au spécimen
Ils varient avec la nature du spécimen et du lieu de ponction
Exemples d'utilisation des tubes en biochimie (les couleurs sont
celles
de la société « Becton Dickinson ».
• Tube héparine (bouchon vert) lonogramme. Ammonium,
Cortisol
• Tube fluoré (bouchon gris) Glucose, Lactate
• Tube sec avec gel séparateur Enzymes, Médicaments,
lonogramme. Substrats (bouchon rouge marbré)
• Tube EDTA (bouchon violet) Hémoglobine glyquée. Bilan
lipidique
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• A-1. La durée de conservation doit être réduite au maximum.
Après décantation, les temps de conservation sont variables
en fonction de la durée et de la température de conservation
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• A-2. Traitement du prélèvement
Pour chaque analyse, il existe une procédure analytique bien
définie, associant les éléments suivants, réunis dans un
manuel interne au laboratoire :
-Logistique: localisation, nom du responsable (numéro de
téléphone), disponibilité, délai de réponse, possibilité de
réponse en urgence, cotation.
- Matériels - méthodes
- Mode opératoire
préparation des spécimens, des réactifs, des calibrateurs,
conditions opératoires du dosage (programmation des
instruments, température, rapport de dilution, durée et
nombre de mesures, nature du blanc réactif, mode,
fréquence et contrôle du calibrage...), calculs (mode
d'expression, conversions du système SI versus système
conventionnel).
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- Performances analytiques : domaine de mesure (limite de
détection, limites de linéarité), précision pour différents
niveaux de concentration (dans la série, de série à série),
exactitude, interférences (endogènes : bilirubine, trouble,
hémolyse-exogènes : médicaments).
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• Lorsque l'imprécision est calculée sur des mesures répétées
dans les mêmes conditions (même série, sans réétalonnage),
on utilise le terme de RÉPÉTABILITÉ.
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• Les erreurs aléatoires affectent tous les échantillons en plus
ou en moins, avec une amplitude variable d'un échantillon à
l'autre. On peut distinguer :
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- les erreurs aléatoires « constantes » : l'amplitude maximale de
l'erreur est constante quelle que soit l'analyse.
Exemple : incertitude sur la détermination du point d'équivalence
lors de mesures titrimétriques.
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• - les erreurs systématiques « constantes » : le biais est
indépendant de l'analyse en cause. Exemples :
- existence d'un trouble non compensé par la soustraction d'un
blanc sérum ou d'un blanc réactif ;
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B.2. Mode d'expression des résultats
• Une très grande rigueur doit être utilisée pour exprimer ces
résultats.
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Les techniques analytiques de
laboratoire médical relevant de la
science transfusionnelle
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Haematologie
1. Les types de cellules sanguines
- Erythrocytes : 4–5.1012 / litre (4–5 . 106 par mm3) de sang.
- Leucocytes : 8 . 109 par litre (8000 par mm3) de sang.
- Thrombocytes (plaquettes): 150–300 . 109 par litre (150000–
300000 par mm3).
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• Coagulation du sang
5–10 minutes
- Le sérum : liquide jaune
- Le cailloux: masse rouge
La présence d’un anticoagulant dans le tube prévient la
coagulation, après centrifugation on obtient
- Le plasma: liquide jaune
- Le culot: les cellules du sang
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• La différence entre le plasma et le sérum
- Le plasma contient la protéine fibrinogène et d’autres
protéines
- Le sérum ne contient pas de fibrinogène mais les autres
protéines sont présentes. Le fibrinogène se transforme en
fibrine insoluble, qui avec les erythrocyt.es forme le cailloux
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2. Collection des spécimens de sang
• Principe:
Le sang veineux et collecté à partir de la veine d’un bras à l aide
une aiguille et seringue
Le sang capillaire est collecté à partir du doit, de l’oreil ou du
talon (pour l’enfant).
• Matériel et réactifs
Pour désinfecter la peau: Coton + 70% éthanol
Gants, garrot, aiguilles
Tubes ou flacons
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• 3. Estimation de la fraction volumique des érythrocytes
fraction volumique des érythrocytes
= volume total des érythrocytes/volume total du sang
Test pour les personnes soufrant d’anémie
La microméthode
• Principe
Le sang (+ anticoagulant) est placé dans un tube capillaire long
puis centrifugé. Le volume atteins par les érythrocytes est lu
par un lecteur à échelle.
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• Technique de mesure
- Les tubes capillaires sont remplie à ¾
- Le tube est scellé à l’une des extrémité avec la cire
- Le tube est placé dans une centrifugeuse Microhaematocrit
- Centrifugation à 3000g/10min
- Lecture du volume
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• La macrométhode
Le sang est collecté dans des tubes gradué Wintrobe (contenant
EDTA), puis centrifugé. Le volume des érythyrocytes est lu
directement à partir du tube.
Le tube Wintrobe est de 9.5 cm x 0.6cm gradué de 0 à 100.
La technique
- Le tube est centrifugé à 2300g/30min
- Lecture du volume des érythrocyte (il donne le pourcentage
donc on divise par 100)
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Le système AB0
30
• Les Antigènes A et B sont des sucres présents
partout dans la nature.
• Passage sanguin
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Pour un groupe donné :
Agglutinines présentes dans le plasma
dirigées contre les agglutinogènes absents
des hématies
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Génotyp
Groupe Antigène Anticorps Fréquence
e
A/A
A A Anti B 45%
A/O
B/B
B B Anti A 9%
B/O
AB A, B - A/B 3%
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Des Antigènes à la surface des hématies :
les agglutinogènes
les agglutinines
Plus petits,
plus puissants,
hémolysent les hématies au lieu de les agglutiner,
dangereux si présents chez un donneur
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• Epreuve globulaire (Beth-Vincent)
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38
39
Test de Beth-Vincent Test de Simonin
Patient 1
Patient 2
Patient 3
Patient 4
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GROUPE SANGUIN VALIDE
ATTENTION :
• En théorie, 2 risques
– Anticorps du receveur contre antigène du
donneur
– Anticorps du donneur contre antigène du
receveur
• En pratique, 1 risque:
– L'antigène du donneur ne doit pas rencontrer
l'anticorps du receveur
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ABO et transfusion
Règle de base : les agglutinines (anticorps) du
receveur ne doivent pas reconnaître les
agglutinogènes (antigènes) du donneur
O AB
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Système Rhésus
• 2ème système de groupe érythrocytaire
Génotype
Phénotype Fréquence
Allèle 1 Allèle 2
D D D+
Rhésus positif
~ 85%
D d D+
Rhésus négatif
d d D-
~ 15%
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Système Rhésus
Génotype
Fréquence
Phénotype le +
en France
probable
D+ C+ E- c+ e+ DCe/dce 34%
D+ C+ E- c- e+ DCe/DCe 20%
Rhésus
D+ C+ E+ c+ e+ DCe/DcE 13% positifs
~ 85%
D+ C- E+ c+ e+ DcE/dce 12%
Autres D+ - 6%
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Système Rhésus
• Applications
– Transfusion:
– D- D+
– D+ D+
– D+ D-
» 1ère transfusion: pas de problème
» Csq: immunisation anti-D du receveur
» Transfusions suivantes:
D- pas de problème
D+ Risque d'accident hémolytique
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Système Rhésus
• Applications
– Transfusion:
» Pour C,E,c,e la meme chose que pour D
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Système Kell
51
52
Anticorps : spécifiques mais irréguliers : non naturels
mais produits seulement après une immunisation :
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• Prélèvements
• Les prélèvements, quels qu'ils soient doivent être effectués
avec le plus grand soin, car leur qualité conditionne
directement les possibilités d'étude.
– les frottis : prélèvement médical au moyen d'un écouvillon
stérile, d'une petite brosse ou d'une petite spatule (par
exemple au niveau du col de l'utérus) ;
– les biopsies : prélèvement de très petite taille d'un tissu, à
des fins d'étude microscopique ;
– les résections d'organes en intégralité, suivies de leur
étude (dans le cas d'une tumeur, déterminer le caractère
bénin ou malin par exemple) ;
– les ponctions de liquides (pleurale, péricardique, etc.)
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• Conservation
• La congélation, utilisée pour les prélèvements en salle
d'opération dont le diagnostic doit être connu rapidement
(examen extemporané);
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• Amincissements
Polymérisation des
Paraffine 5 μm
protéines
Polymérisation des
Résine 1 à 0,05 μm
protéines et lipides
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• Les coupes histologiques
Une coupe histologique est une tranche d'un organe
suffisamment fine pour pouvoir être observée au microscope.
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Microtome
Un microtome est un appareil utilisé pour l'étude (par
coupe histologique) des cellules. Il permet de créer de fines
tranches d'un tissu étudié après fixation (souvent) ou
congélation (Allant de 2 µm à 25µm).
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• Le microtome moderne est construit de
manière à produire de fines tranches de
matière, un peu comme le fait une machine à
couper le jambon opérant un mouvement
vertical alternatif supportant le bloc à couper
et équipé d'un rasoir prismatique fixe affûté
par pâtes diamantées sur plaque de verre.
60
• Un ultramicrotome est un appareil de très grande précision
qui permet des coupes de 80 à 100 nm servant en
microscopie électronique.
61
62
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• Coloration
Les tissus biologiques présentent en eux-mêmes très peu de
contraste, aussi bien en microscopie optique
qu’en microscopie électronique. La coloration est utilisée
aussi bien pour augmenter le contraste que pour mettre en
valeur l’une ou l’autre structure en particulier.
(a) Histochimie
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• Par exemple lors d’une coloration à l’hématoxiline-éosine
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• Histochimie enzymatique
La distribution tissulaire de certaines enzymes spécifiques peut-
être étudiée sur des coupes fraîches en y ajoutant
un substrat spécifique de cet enzyme.
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Historadiographie
Marqueurs radioactifs
Le marquage peut être révélé par visualisation sur microscope à
fond noir des grains d’argents formés par réaction du
rayonnement radioactif sur une plaque photographique.
Immunohistochimie
Des anticorps spécifiques sont utilisés pour venir se fixer à une
molécule de la coupe histologique.
Anticorps fluoréscents
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• Coloration en Microscopie électronique
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Techniques Analytiques relevant de la
Biochimie
70
• Méthodes de dosage des protéines
• Méthodes de dosage des glucides
• Méthodes de dosage des lipides
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Protéines plasmatiques
Les protéines représentent la plus grande partie des
matières solides du plasma. En dehors du
fibrinogène, protéine fibreuse, ce sont toutes des
protéines globulaires.
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• Analyses
L'exploration des protéines plasmatiques est réalisée
par le dosage individuel de telle ou telle protéine,
par le regroupement de quelques dosages, sous le
terme de profil protéique, par l'électrophorèse qui
peut être faite sur des supports différents et enfin
par l'étude éventuelle d'une protéinurie.
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• Dosages protéiques
Ils concernent, soit la protéinémie totale, soit des dosages
individuels de protéines plasmatiques.
Protidémie totale
• Le dosage des protéines ou protides totaux est extrêmement
classique.
• Il est effectué par la traditionnelle réaction du biuret, plus ou
moins modifiée.
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• La réaction du biuret est une réaction mettant en
évidence les liaisons peptidiques.
• La méthode consiste à mettre en milieu basique des
ions cuivre(II) en présence de protéines (ou
de biuret). Un complexe coloré mauve ou violet se
forme en effet lorsque les ions Cu2+ sont complexés à
3 ou 4 atomes de nitrogène des liaisons peptidiques
de la protéine. Plus nombreuses sont les liaisons,
plus grande est l'absorbance.
• biuret ((H2N-CO-)2NH).
• l‘absorbance est mesurée à 565nm
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Deux modification majeures du test du buret.
• L’essai de Lowry
• L’essai acide bicinchoninique
Dans ces tests, le Cu+ formé durant la réaction biuret réagis avec
d’autres réactifs conduisant à l’intensification de la couleur.
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Dosage de protéines particulières
- dosages turbidimétrique ou néphélémétrique
laser après immunoprécipitation,
- dosage radio-immunologique avec marqueur
isotopique,
- dosage immunologique avec marqueur « froid
» : enzyme, composé fluorescent, composé
chimiluminescent.
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• Dosages turbidimétrique ou néphélémétrique laser après
immunoprécipitation
- La réaction (protéine-anticorps) est effectuée dans un excès
d’anticorps
- Dans la turbidimétrie on mesure l’absorbance apparente de la
lumière
- Dans la néphélémétrie on mesure l’intensité de la lumière
diffusée
- Une courbe d’étalonnage est préparée en mesurant la
turbidité d’une série de solution standard contenant des
concentrations connues de la protéine
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• Dosage immunologique
• Les principaux marqueurs utilisés
Système détecteur Exemple
Radio-isotopes Iodine-125, carbone-14,
tritium
Enzymes La raifort peroxydase,
alcaline phosphatase, β-
galactosidase
chimiluminescence Luminol, esters acridinium,
adamantyl dioxetane
bioluminescence Luciférinase/luciférine
Fluorescence Fluorescéine, rhodamine
Europium chélates
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• La turbidimétrie est identique à la photométrie
d'absorption car on évalue la diminution d'intensité
de la lumière incidente lorsqu'elle traverse le milieu
trouble, la lumière transmise étant mesurée dans la
même direction que la lumière incidente.
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• - La néphélémétrie évalue la diffusion de la lumière
sur les particules du milieu trouble, qui dépend de la
taille des particules, de leur indice de réfraction, de
la longueur d'onde de la radiation incidente, émise
ou non par un laser. La lumière diffusée est mesurée
dans une direction différente de celle de la lumière
incidente, avec un angle variable suivant les
appareils du commerce.
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ELISA
Élimination
du sérum
Réaction colorimétrique
Substrat
Chromogène Produit coloré
(ABTS®)
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• Electrophorèse des protéines plasmatiques
Protéinogramme
L'électrophorèse consiste à faire migrer et à fractionner grâce
à un champ électrique, au sein d'un milieu variable et dans un
tampon de pH déterminé, les protéines sont séparées selon
leur charge électrique.
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La technique consiste à;
déposer quelques microlitres de sérum sur le support,
à choisir un tampon, qui est généralement à pH 8,6
auquel les protéines s'ionisent comme des anions,
migrant donc vers l'anode, à laisser migrer durant un
temps fonction du support : 15 à 25 minutes pour
l'acétate, 30 à 60 minutes pour le gel de
polyacrylamide.
85
• Fixation et coloration sont
habituellement faites avec le même réactif.
Cependant le colorant varie avec la nature des
composants à révéler.
Pour le protéinogramme standard les colorants les
plus utilisés sont l'amidoschwarz, le vert de
lissamine, le rouge Ponceau ou le bleu de Coomassie.
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Après transparisation du support, la lecture
photodensitométrique de la coloration de chaque
bande donne le tracé classique (figure) où
apparaissent les 5 pics : Albumine, α1, α2, β et y-
globulines.
L'intégration de la surface de chaque pic conduit enfin à
un pourcentage de chaque fraction, traduit aussi en
gramme/litre si le taux des protéines totales a été
donné à l'appareil.
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• Immunoélectrophorèse et immunofîxation
L'analyse immunoélectrophorétique
Après séparation des protéines par le champ
électrique, on dépose les anticorps (immunsérum
anti-protéines plasmatiques humaines, ou
immunsérums spécifiques de telle ou telle protéine)
dans une gouttière parallèle à l'axe de migration. La
rencontre Ag-Ac se traduit, après la diffusion, par un
arc de précipitation.
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• L'immunofixation
L'électrophorèse des protéines en gel d'agarose est
suivie par une immunoprécipitation in situ des
immunoglobulines avec des antisérums spécifiques de
chaque isotype incubés à la surface du gel.
90
91
Méthodes de dosage des glucide
• Glycémie;
Glycémie et glycosurie sont des urgences techniques : tout
milieu biologique contient toujours assez d'enzymes
glycolytiques pour dégrader le glucose présent et engendrer
rapidement une erreur par défaut : la conservation de
l'échantillon prélevé en l'absence d'agent inhibiteur de la
glycolyse ne doit pas dépasser une heure.
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• Le contenu d'un tube capillaire héparine suffit largement,
récolté à la pulpe du doigt après coupure par vaccinostyle
ou au talon pour le nourrisson.
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• Le prélèvement doit être effectué chez un sujet
strictement à jeun depuis 10 heures.
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• Méthodes de dosage
Les méthodes enzymatiques représentent 99 % des
techniques utilisées. 80 % utilisent la glucose oxydase, 7 %
l'hexokinase.
Méthode à la GOD/POD :
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GLUCOSE OXYDASE PEROXYDASE
COMPLEXE ROUGE
RÉACTIF RÉDUIT INCOLORE absorbe à 525 nm
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Cette méthode peut aussi être réalisée à l'aide de bandelettes
réactives dont l'extrémité, imprégnée de réactifs,reçoit une
goutte de sang. La variation de coloration est appréciée soit
visiblement à l'aide d'une échelle colorée soit par un lecteur
portable indépendant et elle permet d'estimer la valeur de la
glycémie.
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Méthode mesure de la production de l’oxygène par
une électrode
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D'autres méthodes mettent en jeu des réactifs à base de
coenzymes nicotiniques comme indicateurs.
4H2O
100
• Dosage du cholestérol
• Le cholestérol peut être dosé par de très nombreuses
méthodes. Les plus anciennes sont colorimétriques, les plus
pratiquées sont enzymatiques.
• La méthode de référence est chromatographique.
101
• Elles utilisent toutes une cholestérol estérase
et une cholestérol oxydase.
Cholestérol
CE CL + AG
Estérase
104
• Dosage du cholestérol HDL
105
• Dosage des enzymes
Principe général de la mesure d'une activité
Pour déterminer l'activité enzymatique d'une enzyme on utilise
la réaction catalysée par l'enzyme et l'on dose la quantité de
produit formé ou la quantité de substrat détruite au cours
d'un temps déterminé (la minute).
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• Méthode calorimétrique en point final
Exemple : phosphatases alcalines déterminées par la méthode
de Bodansky.
Les phosphatases alcalines agissent sur le (3 glycérophosphate
pour le transformer en glycérol et acide phosphorique. Le
dosage en point final des phosphates produit une coloration
proportionnelle à la quantité de phosphatases alcalines dans
le sérum.
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• Méthode colorimétrique en cinétique
Exemple : phosphatases alcalines déterminées par la méthode
de Bessey Lowry.
phosphatase
Paranitrophényl phosphate + H2O ————> paranitrophénol +
acide phosphorique
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• Introduire un coenzyme nicotinique (NAD,
NADH.H+)
TGO
1) L-aspartate + a-cétoglutarate oxaloacétate + L-
glutamate
MDH
• 2) Oxalaoacétate + NADH+ L-malate +
NAD+
109
Dans les liquides biologiques, les résultats sont
exprimés en unités internationales (UI) ou en unités
par litre (U/l). Une nouvelle unité doit remplacer
l'unité internationale, le katal.
110