Biologia Molecular Uam

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Biologa molecular en medicina: nuevas

estrategias que originan nuevos desenlaces
Article February 2014
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2 authors:
John Fredy Castro-lvarez Germn Campuzano-Maya

Corporacin Universitaria Remington, Medell Laboratorio Hematologico
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Caracterizacin clnica y epidemiolgica de la esclerosis mltiple en el rea metropolitana del Valle

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La clnica y el laboratorio
Biologa molecular en medicina: nuevas

estrategias que originan nuevos desenlaces
Molecular biology at medicine: new strategies that leads to new outcomes
John Fredy Castro-lvarez PhD1, German Campuzano-Maya MD2
Resumen: El avance cientfico y tecnolgico de la biologa molecular en el mundo trajo un nuevo

abordaje de los problemas biolgicos, que ha permitido dar paso a una nueva etapa de la investigacin
cientfica en la biologa, la qumica y la fsica, as como a nuevas prcticas en la medicina. El uso de
las herramientas de la biologa molecular como apoyo diagnstico en un amplio nmero de enfermeda-
des infecciosas y de base gentica es uno de los campos que mayor desarrollo tiene actualmente en la
medicina. Esta rea de la prctica mdica se circunscribe en el uso de la informacin gentica (ADN y
ARN) de los individuos para el diagnstico y tratamiento de la enfermedad desde la patologa molecular
y la terapia gnica, y actualmente, en el control y prevencin de las mismas desde la identificacin de
factores de riesgo y el uso de esta informacin en la epidemiologa molecular. Este mdulo da inicio a
una completa seleccin de temas de medicina y biologa molecular que introducirn al lector en el qu,
por qu y para qu de las herramientas de la biologa molecular que se usan actualmente en los mejores
laboratorios clnicos y de investigacin en el mundo para la prevencin, apoyo diagnstico y teraputica
de un amplio nmero de enfermedades.
Palabras clave: Medicina molecular, biologa molecular, diagnstico clnico, ADN, ARN, protenas,
reaccin en cadena de la polimerasa.
Abstract: Scientific and technological development of molecular biology in the world generated a new
approach in the biological problems, which have opened a new era of scientific research in biology,
chemistry, and physics, as well as to new procedures in medicine. The use of molecular biology tools
in diagnosis of a wide range of infectious and genetic diseases is currently the base that supports the
medical practice. This area of medicine is related with the genetic information use (DNA and RNA), of
the subjects for diagnosis and treatment of the disease since molecular pathology and gene therapy, and
the control and prevention of disease with the risk factors identification and the use of this information
in the molecular epidemiology. This article is the beginning to a reviews series of molecular biology
and medicine, that will introduce the reader in the what, why and how of the molecular biology tools
currently used in clinical and research laboratories in the world for the prevention, diagnosis, and the-
rapeutic support of a wide number of diseases.
Key words: Molecular medicine, molecular biology, clinical diagnosis, DNA, RNA, proteins, polyme-
rase chain reaction.
Castro lvarez JF, Campuzano Maya G. Biologa molecular en medicina: nuevas estrategias que
originan nuevos desenlaces. Medicina & Laboratorio 2014; 20: 11-42.
1
Microbilogo y Bioanalista, MSc en Biologa, PhD en Biologa. Grupo de investigacin en Patologa Clnica. Laboratorio Clnico
Hematolgico. Medelln, Colombia. Correo electrnico: [email protected]
2
Mdico especialista en Hematologa y Patologa Clnica. Docente Ad Honorem, Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia.
Coordinador Grupo de investigacin en Patologa Clnica. Mdico Director, Laboratorio Clnico Hematolgico. Medelln, Colombia.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Medicina & Laboratorio 2014; 20: 11-42.
Mdulo 1 (La clnica y el laboratorio), nmero 102. Editora Mdica Colombiana S.A., 2014
Recibido el 30 de noviembre de 2013; aceptado el 30 de enero de 2014
Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 11

Castro-lvarez JF, Campuzano-Maya G
L a biologa molecular, entendida hoy en da como el rea de estudio de las molculas de ci-
do desoxirribonucleico (ADN) y de cido ribonucleico (ARN), es un campo que vincula di-
ferentes aproximaciones en el funcionamiento de cualquier organismo vivo. A nivel molecular,
el ADN y el ARN estn encargados de preservar y traducir a protena la informacin necesaria
para el funcionamiento celular, acompaado de los lpidos y carbohidratos, que en conjunto con
las protenas estructuran, mantienen y dinamizan el complejo molecular conocido como clula.
En el nivel celular, los procesos de la gnesis, la diferenciacin, la divisin y la muerte, genera-
dos por la interaccin coordinada de las molculas tanto en el interior como en el exterior de la
clula, permiten jerarquas de organizacin y separacin funcional en los tejidos y los rganos
que componen nuestro organismo. Por ltimo, a nivel tisular, las molculas y sus productos
celulares generan de forma sinrgica un organismo como el ser humano que cuenta con ms de
100 billones de clulas que interactan constantemente de forma coordinada en sistemas como
el nervioso, el muscular, el seo, el digestivo, el respiratorio y el circulatorio, entre otros [1].
La biologa molecular es la base estructural y funcional de cualquier organismo vivo, pero des-
de una mirada crtica al reduccionismo cientfico, no tiene la respuesta a todos los interrogantes
acerca de la vida que se plantea el ser humano. El ADN y el ARN son una parte esencial de
cualquier clula, pero a nivel celular, tisular y en el organismo vivo, slo son actores de un
sistema biolgico que se encuentra en contina comunicacin consigo mismo y con el medio
que lo rodea. Los procesos patognicos en el ser humano son la ms clara evidencia del rol cen-
tral del ADN y ARN en enfermedades de base gentica como la fibrosis qustica, la hemofilia,
la enfermedad de Huntington y algunos tipos de cncer de origen gentico; pero a su vez, es
posible encontrar una participacin limitada en trastornos multifactoriales como la diabetes, la
enfermedad cardiaca, la obesidad y la demencia, entre otras [2].
En este mdulo de biologa molecular se pretende hacer un recorrido conceptual de las bases
cientficas y tecnolgicas que permitan hacer una aproximacin del uso de esta disciplina en
la medicina, describiendo los conceptos bsicos ms importantes para el rea de la salud, que
faciliten la comprensin del uso de las herramientas de la biologa molecular en la prctica
mdica cotidiana y la utilidad clnica de las pruebas de laboratorio moleculares en la prevencin,
el diagnstico y el tratamiento de diversas enfermedades. Para conocer ms a fondo los
componentes que hacen parte de la relacin entre la medicina y la biologa molecular es necesario
hacer un rpido recorrido por la historia y los conocimientos cientficos acerca de la clula, los
mecanismos que permiten el almacenamiento y transferencia de la informacin gentica hasta
culminar en la aplicacin de este conocimiento en el ejercicio mdico y el laboratorio clnico.
Este primer artculo del mdulo de biologa molecular es el comienzo de una completa seleccin
de temas de medicina y biologa molecular que introducirn al lector en el qu, el por qu y el
para qu de las herramientas de la biologa molecular que se usan actualmente en los mejores
laboratorios del mundo para la prevencin, el apoyo diagnstico y la teraputica, entre otros.
De la estructura
del ADN a la era de las micas
En la historia de la biologa molecular se pueden encontrar tres momentos que han marcado
el desarrollo cientfico y tecnolgico de la biologa y la medicina, y que han y seguirn
dejando alguna una marca imborrable en la sociedad. El primero de ellos fue la descripcin
12 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

Medicina molecular: nuevas estrategias que originan nuevos desenlaces
de la estructura de la doble hebra de ADN que realizaron Watson y Crick en 1953 [3],
descubrimiento que los catapulto a obtener el premio Nobel en 1962 por su aporte a la
descripcin de las bases bioqumicas que posibilitan la codificacin de la informacin
gentica en las clulas. Este suceso poco valorado en su tiempo, abri en la historia la
posibilidad de descifrar los misterios ms recnditos de la vida desde un cdigo gentico
conformado por cuatro letras: A-T-G-C.
Todo nuevo abordaje conceptual genera nuevas preguntas, y con stas, nuevas herramientas
para resolverlas. Es as como en la dcada de los setenta, con la posibilidad de obtener
e identificar fragmentos de material gentico, se da otro salto conceptual en la historia
de la ciencia y posiblemente de la humanidad, al poder manipular el material gentico
de cualquier organismo vivo con el desarrollo del ADN recombinante [4]. Este ADN es
sintetizado en el laboratorio y puede ser introducido en cualquier clula u organismo
vivo para eliminar (del ingls knock-out) o adicionar (del ingls knock-in) genes del cdigo
gentico o genotipo original, y generar un cambio en la estructura o el comportamiento
del organismo tambin conocido como fenotipo. Unido a este gran avance, en 1986, se
desarroll la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (del ingls polymerase chain reaction)
que permite aislar un slo fragmento especfico de ADN y generar millones de copias hasta
hacerlo visible o identificable a los ojos humanos [5]. En conjunto, estos tres desarrollos
cientficos y tecnolgicos rodeados de diferentes descubrimientos y publicaciones en
el rea, estructuran la biologa molecular que hoy en da abre un nuevo panorama a la
medicina.
El segundo momento en la historia de la biologa molecular se da en el auge de estos

desarrollos, al concebir la posibilidad de leer el cdigo gentico, fragmento a fragmento,
como un libro separado por 46 captulos denominados cromosomas. La automatizacin de
las herramientas de laboratorio y el acelerado avance de la biologa molecular dan origen,
en 1990, al Proyecto genoma humano, liderado por el cientfico norteamericano Francis
Collins. Una alta inversin de capital, un equipo de cientficos de diferentes pases y el
acceso a la tecnologa de punta, genera un borrador inicial del genoma humano en el ao
2000, con la publicacin de los resultados en el 2001 [6] y la culminacin del Proyecto en el
2003 [7]. Este gran logro sin precedentes en la historia de la humanidad est ligado a tantas
preguntas como secuencias descritas; indagando desde la genmica, como se le conoci al
estudio del genoma, muchos de las inquietudes que existan en la biologa y la medicina.
Los aproximadamente treinta y ocho mil genes o secuencias con sentido biolgico descritos
en el Proyecto genoma humano, dan paso al tercer momento de la historia conocido como la
era de las micas. En este punto es importante aclarar que los genes o secuencias con sentido
biolgico son descritos desde la utilidad o desde una explicacin netamente teleolgica,
que asume que una secuencia especfica de ADN produce una protena en particular con
una funcin definida. La genmica pretenda que conociendo la secuencia y el lugar en
que se encontraba cada gen en el genoma completo, se podra descifrar su funcin, y dar
explicacin a grandes misterios del ser humano como las bases de la inteligencia y el origen
de muchas enfermedades. A favor de la humanidad, los resultados del Proyecto genoma
humano generaron una de las ms grandes frustraciones, y a la vez, una de las ms grandes
conclusiones de la ciencia en la actualidad: el genoma humano es un componente de un

sistema complejo y dinmico que cambia e induce cambios constantemente al ambiente

al que pertenece, el cual, al mismo tiempo, induce cambios sobre l, en un ciclo constante
y dinmico de relaciones. El soporte de esta conclusin es evidente al identificar que un
ratn y una planta (p. ej., Arabidopsis spp.), tienen la misma cantidad de genes que el ser
humano, pero cada uno de ellos cuenta con desarrollos totalmente diferentes [6, 7].
Los interrogantes actuales que ha generado el Proyecto del genoma humano estn
encaminados a identificar, ya no slo al ADN (genmica) como la base de la explicacin
de la vida, sino tambin al ARN (transcriptmica), las protenas (protemica), los
carbohidratos (glicmica), los lpidos (lipidmica), los metabolitos (metabolmica), cmo
estas molculas interactan entre s (interactmica), entre otras muchas aproximaciones;
y al uso de algunas herramientas computacionales como la bioinformtica y la biologa de
sistemas, que permiten pensar en la modelacin molecular de la clula y el tejido en tiempo
real desde la Matemtica (ver figura 1) [8]. Los desarrollos cientficos y tecnolgicos de la
biologa molecular, la genmica y actualmente el influjo de otras micas, han permeado
constantemente la prctica mdica [8-10]; poco a poco son muchas las aplicaciones que
dan resultados tangibles desde el mejoramiento en el diagnstico de las enfermedades,
la identificacin de factores de riesgo gentico, la generacin y la administracin de
medicamentos basadas en informacin molecular, el uso de la terapia gnica para el
tratamiento de algunas enfermedades, entre otros acercamientos que han dado un salto de
inmensas proporciones y han permitido el ingreso de la biologa molecular a la medicina
y con ella a la vida cotidiana [11].
Clulas/tejidos
Bioinformtica
Cromosomas
Lpidos
Genmica Glicmica
Carbohidratos
ADN
Lpidmica
Transcriptmica
Protena
ARNm Aminocidos Metabolmica
Protemica
Figura 1. Contexto celular que cubre los tres momentos de la historia de la biologa molecular. La hebra
de ADN como unidad de almacenamiento de informacin en los cromosomas y la relacin unvoca con
el ARN para la produccin de protenas, que en conjunto con los carbohidratos y los lpidos mantienen la
dinmica celular. A su vez, se muestra la interrelacin que se genera entre el desarrollo de la genmica y
el progreso de la era de las micas.

El genoma humano
Las clulas del cuerpo humano almacenan la informacin gentica en 23 pares de cromosomas,
a excepcin del vulo y el espermatozoide, que slo tienen un juego de 23 cromosomas, y el
eritrocito y la plaqueta, que en el proceso de diferenciacin pierden su ncleo y por ende no
tienen informacin gentica en su interior. Los cromosomas contienen el ADN y estn agrupados
en el ncleo de la clula en conjunto con protenas, ARN, lpidos, carbohidratos y compuestos
orgnicos e inorgnicos que permiten la replicacin del ADN en el proceso de formacin de
nuevas clulas [1]. Para la lectura del cdigo gentico y la produccin de protenas en la clula
se da la transcripcin (o paso de ADN a ARN) que permite la decodificacin y organizacin
de la informacin almacenada en el cdigo gentico que va ser traducida a protenas; el ARN
generado pasa al citoplasma donde el cdigo es traducido, aminocido por aminocido, hasta
formar una protena por el mecanismo de traduccin. Esta secuencia de eventos biolgicos se
conoce como el dogma central de la biologa, el cual funcion durante varias dcadas como un
patrn de respuesta unidireccional ADN ARN protena con un nico sentido teleolgico,
que presentaba al ADN y el ARN como intermediarios para producir protenas.
La publicacin del genoma humano, en conjunto con otros trabajos, trajo consigo la cada
del dogma central de la biologa, al dar a conocer que slo el 2 % del genoma humano
contiene genes productores de protenas y que el 98 % restante es basura, como explicaran
algunos cientficos, o tiene otras funciones, como se ha descrito actualmente [7, 9, 10]. Las
modificaciones estructurales del ADN, las interacciones ADN-ADN, ADN-ARN, ADN-
protena, entre otras, han demostrado que el sentido unidireccional del dogma central ADN
ARN protena se ha transformado en un esquema multidireccional de interacciones
complejas, difcilmente entendibles con el esquema reduccionista y mecanicista que ha
imperado en la concepcin de la ciencia algunos siglos atrs (ver figura 2). El llamado actual
que est realizando la biologa molecular a la medicina, es la bsqueda de la complejidad
intrnseca de los procesos patolgicos para la comprensin, la prevencin, el diagnstico y el
tratamiento de los mismos [10].
Transcripcin Traduccin
ADN ARN Protenas
Replicacin
Transcripcin Traduccin
ARN
ADN Protenas
Transcripcin
Factores de reversa Virus ARN Priones
transcripcin
Figura 2. La relacin del ADN, el ARN y las protenas. A. Antiguo dogma central de la biologa y B.
algunos de los descubrimientos que han llevado a generar una visin dinmica y multidireccional del
dogma central de la biologa.

A continuacin se realizar una revisin general de los mecanismos centrales que hacen parte
de la codificacin y decodificacin del cdigo gentico, con miras a entender el principio de
una de las herramientas moleculares ms utilizadas actualmente en la medicina: la reaccin
en cadena de la polimerasa.
El ADN y la replicacin
Despus de 1953, el concepto de ADN tom forma y fue representado como una doble hlice [3,
12]. Los nucletidos, que son compuestos formados por un azcar, una base nitrogenada y un
grupo fosfato, unen la doble hlice por medio de apareamientos complementarios entre las bases
nitrogenadas, y a su vez, cada hlice est anclada por los grupos fosfato de cada nucletido, para
conformar cadenas dobles de forma espiral de hasta 220 millones de nucletidos unidos (ver
figura 3). Las bases nitrogenadas que conforman los nucletidos dan el nombre a cada una de las
letras que generan el cdigo gentico: la A es la adenina, que se une a la T, denominada timina;
as como la C, de citosina, se une a la G, conocida como guanina. Estas cuatro letras forman
tripletas en la hebra de ADN, denominadas codones, las cuales representan un aminocido en
particular cuando se realiza la traduccin del cdigo gentico a la protena. En el genoma se
conocen 64 codones que producen 20 aminocidos, una seal de inicio para el paso de ARN a
protenas y tres seales de terminacin del proceso [1].
3
5 OH
F O A T
Az
5
4
Az 1
Puente
de hidrgeno O
3 2
F
F O G C
Az
6
Az O
F
1 A G
F 5
4
Az
O
1
T A Az T
C
O
3 2
F
OH 5
3 Pares de bases
2
Clula
Ncleo
5
Cromosoma ADN de doble
hebra
Histonas
Telmero
Centrmero
3
4
Nucleosomas
Cromtidas
Figura 3. La biologa molecular a escala. 1) El ser humano como un sistema de rganos y tejidos interrela-
cionados, que de forma coordinada logra estructurar, coordinar, regular y preservar funciones bsicas y
de alta complejidad al mismo tiempo. 2) La clula como unidad bsica de autoregulacin, que posibilita
la interaccin de protenas, lpidos, carbohidratos y cidos nucleicos para generar una base funcional
microscpica del ser humano. 3) El ADN empaquetado en estructuras superenrrolladas, que dan forma
a 23 pares de cromosomas en constante dinmica e interaccin con diferentes componentes de la clula

para un adecuado almacenamiento y transmisin de la informacin. 4) La interaccin ADN y protena,

que limita y a la vez posibilita la produccin de ARN y protenas requeridas en un espacio y tiempo deter-
minado de la clula. 5) y 6) La doble cadena de ADN en pares de bases complementarias conformada por
un grupo fosfato (F), un azcar (Az) y cuatro nucletidos: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina
(G) del almacenamiento de la informacin gentica en la clula.
En este punto es importante destacar que el cambio o mutacin de un slo nucletido en el ADN
puede variar o modificar una tripleta, lo que afecta la produccin de una protena especfica
y puede generar una alteracin celular y tisular, que al no ser compensada o eliminada en
la clula o tejido puede ser evidenciada en la prctica clnica como una enfermedad. Las
mutaciones pueden ser espontneas o inducidas, la primera de ellas se da de forma fortuita
en los procesos de replicacin del ADN o por cambios aleatorios de la secuencia, y la segunda
es debido a agentes mutagnicos externos como la radiacin, los virus y algunos agentes
qumicos. Aunque las mutaciones se pueden presentar durante la vida de cualquier ser
humano, es necesario que se expresen en las clulas reproductoras para ser heredado y que
no slo se encuentre en el 2 % del ADN codificante, sino que tambin afecte un aminocido
en particular asociado con la funcin de una protena. A pesar de la baja probabilidad de
que suceda un cambio biolgico que altere la funcin de una protena, las mutaciones hacen
parte de nuestra diversidad como seres vivos y es necesario escudriar los mecanismos que
la producen, siendo la replicacin del ADN uno de los ms importantes en la generacin de
mutaciones espontneas [9, 10].
En trminos generales, la replicacin del ADN se inicia con la separacin de la doble hlice para
generar a partir de cada una de las hebras parentales (cadenas originales o hebras molde) dos
hebras hijas complementarias (cadenas nuevas), lo que da originen a copias idnticas del material
gentico de doble cadena, formadas por una hebra parental y una hebra hija (ver figura 4). La
secuencia de eventos se inicia con la participacin de la enzima helicasa, que se encarga de
separar las hebras parentales para que la enzima ADN polimerasa, a partir de una secuencia
corta de nucletidos, conocida como cebador (del ingls primer), que es complementaria a la
hebra molde de sentido 3 5, sintetice una nueva hebra en direccin 5 3 (ver figura 4). El
crecimiento de la nueva hebra se realiza por la unin del grupo hidroxilo (-OH) en el carbono
3 del azcar, que est libre en el cebador, y el grupo fosfato (PO43) en el carbono 5 del azcar
del nucletido que va a ser insertado, dejando libre nuevamente un grupo hidroxilo 3, al cual
puede unirse un nuevo nucletido. De sta manera, el extremo de la cadena de ADN donde
se encuentra el grupo hidroxilo 3 libre corresponde al extremo 3, y el lado opuesto, donde se
encuentra el grupo 5 fosfato libre, el extremo 5 (ver figura 3, tem 6) [13].
Debido al sentido antiparalelo del ADN, la replicacin de la hebra molde complementaria debe
realizarse en tiempos similares a la otra cadena, para asegurar que la copia sea fiel e igual en
ambas hebras. Dado que el ADN se sintetiza extendiendo el extremo 3, slo a partir de la hebra
molde de sentido 3 5 se tendr una sntesis continua de la nueva cadena, conocida como
hebra lder o adelantada. Por su parte, a partir de la cadena molde complementaria de sentido 5
3, la ADN polimerasa realizar la sntesis de la nueva cadena, conocida como hebra rezagada
o retrasada, en direccin 5 3, pero extendiendo el extremo 3 de manera discontinua y a
partir de secuencias cortas del ADN molde, que darn como resultado pequeos fragmentos de
ADN nuevo, denominados fragmentos de Okasaki, los cuales con la ayuda de la enzima ADN
ligasa se unen y dan origen a una copia continua, completa e idntica [13].

Replicacin del ADN Cadena nueva

(lider)
5
Cadena original
5 3
3
5 Cebador
3 3
Cadena original
5
Cadena nueva
(rezagada)
Transcripcin de ADN a ARN Figura 4. Representacin esquemtica del
almacenamiento de la informacin gentica
en la clula. Mecanismos de replicacin del
ADN
ADN: a partir de una hebra doble de ADN
que sirve de molde (cadena original), se ge-
neran dos cadenas dobles de ADN, forma-
das por una cadena original y una cadena
ARNm
nueva (cadena hija) que contienen la misma
informacin gentica para la divisin celular.
ARNt Transcripcin del ADN a ARN: proceso para
Traduccin de ARN a protenas
la transmisin de la informacin almacenada
Protena en el ADN de doble hebra hacia una cadena
sencilla de ARN que lleva la informacin re-
Ribosoma
Aminocidos (ARNt +
querida para la produccin de una protena
protenas)
particular. Traduccin del ARN a protenas:
lectura y traduccin del cdigo gentico que
proviene del ADN y que se transporta al cito-
ARNm plasma en tripletas de ARN para convertirse
en una protena, aminocido por aminocido.
El ARN y la transcripcin
A pesar de contar con el mismo material gentico, las clulas del cuerpo humano poseen
caractersticas totalmente diferentes; una clula sea, una clula sangunea, una neurona, una
clula epitelial y una clula muscular, difieren cada una con respecto a la otra en la forma,
el tamao, la localizacin y la funcin. Estas diferencias se originan de clulas madre que
contienen un material gentico totalmente idntico, pero que se procesa de forma diferente
dependiendo del medio circundante y de los mecanismos celulares intrnsecos que permiten
la organizacin de los diferentes sistemas en el cuerpo humano. De los 3,2 billones de
nucletidos presentes en los 23 pares de cromosomas, slo el 2 % (64 millones de nucletidos)
se ha demostrado que es codificante o que puede ser transformado a protena [7], siendo el
paso de ADN a ARN (transcripcin), un paso esencial y determinante en la diversidad celular.
La transcripcin se ha descrito como el paso de la informacin almacenada en las hebras de

cadena doble de ADN a cadenas sencillas de ARN, el cual lleva consigo las tripletas especficas
que darn forma a la protena, aminocido por aminocido (ver figura 4). Este mecanismo
permite en parte la seleccin, el procesamiento y el transporte del ARN a los ribosomas para la
produccin de las protenas que mantienen la forma, el tamao, la localizacin y la funcin de
cada clula en su ambiente especfico. El tipo de almacenamiento y las modificaciones qumicas
que alteran la funcin del ADN sin cambiar su secuencia es denominado epigentica, la cual
determina los genes o partes del ADN que pueden ser accesibles por las protenas encargadas
de hacer la conversin a ARN. Los mecanismos epigenticos o epigenoma comprenden la

metilacin del ADN, la modificacin de las histonas (protenas que empaquetan el ADN) y los
mecanismos de impronta gentica, es decir, de informacin parental, que facilitan o dificultan
el acceso a determinadas secuencias del ADN [1, 14].
El empaquetamiento del ADN en los cromosomas se realiza con la ayuda de las histonas,
que permiten que un ADN superenrollado se envuelva a su alrededor formando estructuras
conocidas como nucleosomas que a su vez se enrollan y forman estructuras cada vez ms
compactas hasta dar lugar a los cromosomas (ver figura 3). A las regiones en el cromosoma
con mayor compactacin del ADN se le conoce como heterocromatina y a las de menor
compactacin como eucromatina; en estas ltimas es donde se encuentra mayor actividad
transcripcional y en las que se ubican regiones determinantes en los procesos de mantenimiento
de la forma, el tamao, la localizacin y la funcin de cada clula [1]. Este proceso que fue
considerado como accesorio en el empaquetamiento del ADN, cada vez adquiere mayor
utilidad biolgica y comienza a ser determinante en la prctica mdica por su participacin
en diferentes enfermedades [15].
El actor principal de la transcripcin es el ARN, el cual se diferencia del ADN en el azcar que
lo compone, siendo una desoxirribosa la del ADN y una ribosa la del ARN, en el reemplazo
del nucletido timina (T) por el uracilo (U) y que usualmente se presenta como una hebra
sencilla, a diferencia del ADN que es de doble hebra. Estas caractersticas del ARN llevan a
que sea fcilmente degradado en la clula y que a excepcin de algunos virus, no almacene
informacin gentica como lo hace el ADN. Tambin es importante nombrar que hay varios
tipos de ARN como: i) ARN mensajero (ARNm) que lleva la informacin almacenada en
el ADN hacia los ribosomas; ii) ARN de transferencia (ARNt) que se encarga de adicionar
los aminocidos a la protena en formacin segn cada tripleta especifica en el ARNm; iii)
ARN ribosomal (ARNr) que forma los ribosomas en conjunto con protenas ribosomales,
y es esencial para la interaccin del ARNm y el ARNt (ver figura 4), y adems, iv) ARN
no codificantes (ARNnc), como los ARN interferentes que empiezan a ser centrales en los
procesos de regulacin genmica [1].
La transcripcin tiene dos fases esenciales en la transmisin del mensaje del ADN a la protena:
la produccin de la hebra de ARN a partir de una de las hebras de ADN y el procesamiento de
la hebra de ARN para llevar el mensaje adecuado que se traducir a protena y evitar que sea
daada en su camino a los ribosomas. Estos mecanismos requieren la participacin de varios
actores que permiten seleccionar la secuencia especfica en el ADN que ser transcripta,
entre los cuales estn las regiones en el ADN conocidas como promotoras que indican la
posicin del gen en la que debe iniciarse la transcripcin, y las protenas llamadas factores
de transcripcin que reclutan la maquinaria necesaria para iniciarla. Cada regin codificante
en el ADN contiene bloques de secuencias codificantes, llamados exones, que van a hacer
parte del ARNm, los cuales se encuentran separados entre s, por bloques de secuencias no
codificantes, que no participan en la produccin de la protena, denominadas intrones. Ambos
bloques de secuencias son transcritos a ARN, pero antes de que sea llevado a los ribosomas,
los intrones son removidos y los exones se unen en un proceso conocido como empalme (del
ingls splicing), que dar origen al ARNm maduro el cual, una vez en el ribosoma, genera
una secuencia de aminocidos que dar forma a una protena que va a hacer parte de una
dinmica celular [13].

Los mecanismos que regulan la transcripcin han mostrado que la expresin de genes
puede estar controlada desde el exterior de la clula por factores solubles como el estrgeno,
pasando por diferentes protenas presentes en el citoplasma y llegando hasta secuencias
presentes en el mismo gen que determinan la cantidad y variedad de las protenas en nuestro
organismo. El dogma central de la biologa ADN ARN protena termina perdiendo todo
sentido al identificar que hay protenas que regulan la disponibilidad o no del ADN para la
transcripcin, que hay ARN no codificante necesario para el ensamblaje de las protenas, que
a su vez pequeas piezas de ARN son capaz de unirse al ARNm e inhibir su paso a protena.
Estos son slo algunos de los mecanismos descritos en la actualidad, resaltando que es un
campo de estudio al que han llegado muchos investigadores con base en las posibilidades que
presenta el 98 % del ADN que es no codificante, el cual es transcripto de ADN a ARN en su
mayora y que hasta el momento es muy poco lo que se conoce sobre la funcin e implicacin
en el campo de la medicina [16].
Las protenas y la traduccin

Al igual que la genmica, la protemica ( estudio de las protenas) como conjunto y su
participacin en la clula, asumi la responsabilidad de resolver los misterios del ser
humano desde el conocimiento de las protenas, lo que logr mover la ilusin frustrada
de la genmica al producto final de la va ADN ARN protena. Este auge fue muy
corto comparado con el de la genmica, debido a la variabilidad intrnseca que existe de
una clula a otra en la cantidad, la localizacin y la actividad de cada protena; adems, de
diversas modificaciones que se llevan a cabo en las protenas despus de ser ensambladas
en los ribosomas [17]. Estos cambios facilitan que la clula sea un sistema dinmico
que est en constante transformacin y que tiene la posibilidad de autorregularse para
mantener la forma, el tamao, la localizacin y la funcin celular que se requiere en un
tejido especfico. La era de las micas y la biologa computacional son la respuesta que
se ha generado a las inquietudes que deja una visin cientfica reduccionista de la vida,
la cual se intent explicar desde una sola molcula. Actualmente, la biologa molecular
desde la medicina asume una visin sistmica del organismo, para entender, con ayuda de
las nuevas herramientas moleculares, los procesos patolgicos como procesos complejos
y dinmicos que requieren aproximaciones diagnsticas y teraputicas con las mismas
caractersticas [18, 19].
Los mecanismos que permiten la produccin de las protenas ya han sido mencionados
en los prrafos anteriores, pero es necesario recopilar de forma breve, la interaccin
de los actores claves del paso del ARN a las protenas y cmo llegan a desempear su
funcin. El punto de inicio de la traduccin es un ARNm maduro, es decir, slo con los
exones necesarios para producir la protena en particular; cabe aclarar que el empalme del
ARN no slo elimina los intrones, tambin puede eliminar algunos exones para producir
diferentes isoformas de una protena. Una vez el ARNm sale del ncleo y llega a los
ribosomas que se encuentra en el citoplasma, se encuentra con los ARNt y los ARNr, que
como se describi anteriormente, van a ser esenciales en la interpretacin de las tripletas
que trae el ARNm y la traduccin de las tripletas, poniendo aminocido por aminocido
hasta formar una cadena de aminocidos o cadena polipeptdica, que da forma a la
protena (ver figura 4) [1].

La configuracin tridimensional de la protena y los cambios necesarios para que la protena

tenga un lugar y una actividad en la clula est determinada por las modificaciones
postraduccionales, es decir, cualquier cambio que ocurra despus de la traduccin, las
cuales se inician en el retculo endoplsmico, pasan al aparato de Golgi y luego darse
en cualquier parte de la clula. As, a medida que nos adentramos en la dinmica de
la clula vamos a encontrar que la visin teleolgica que considera a cada componente
molecular con una funcin definida, se revalida y da cuenta que los componentes de la
clula interactan en tiempo y espacio determinados, dando como resultado patrones que
pueden ser identificables pero no predecibles fcilmente. Por esta razn, la medicina debe
comprender la diversidad de los seres humanos en el nivel molecular, celular y tisular,
construyendo las herramientas necesarias para asumir una medicina personalizada,
donde las condiciones patolgicas puedan tener aproximaciones diferentes que concluyan
en tratamientos totalmente dismiles a los convencionales [10].
Mtodos de aislamiento
de ADN y ARN en el laboratorio clnico
El rpido crecimiento del conocimiento cientfico y tecnolgico en el rea de la biologa
molecular est realizando un cambio discreto, pero estructural de la visin actual de
la medicina. La imperiosa necesidad de generar desde la investigacin cientfica un
conocimiento til y que sea aplicado continuamente a la solucin de problemas biolgicos,
con el soporte del desarrollo tecnolgico, ha venido creando una nueva visin de la
medicina y el laboratorio clnico. Este avance dirigido y coordinado, poco a poco introduce
las micas y los anlisis sistmicos de los pacientes y las enfermedades al anlisis clnico;
para los cuales los mdicos, el personal del laboratorio y otros profesionales del rea de la
salud, deben contar con los elementos tericos necesarios para comprender, discriminar,
usar e interpretar las herramientas moleculares que den respuestas tiles y confiables
ante las necesidades del da a da en el quehacer mdico. Esta revisin, que da cuenta
del paso de la biologa molecular por la medicina, es apenas un abrebocas a las tcnicas
y tecnologas moleculares usadas actualmente en los laboratorios clnicos, as como de la
utilidad clnica de estas pruebas en nuestro medio; temticas que se pretenden abordar en
futuras entregas de la revista Medicina & Laboratorio. Para esta ocasin, se describirn los
mtodos de aislamiento de ADN y ARN, as como el mtodo de amplificacin y anlisis
de cidos nucleicos ms utilizado en la actualidad en el mbito clnico conocido como la
reaccin en cadena de la polimerasa.
Toma de la muestra
Los cidos nucleicos como el ADN y el ARN se pueden obtener de diferentes fuentes y
no requieren de condiciones especiales para el transporte y la conservacin. La sangre
total es una de las fuentes de mayor uso actualmente debido a que se pueden obtener
muchas clulas nucleadas de un paciente, y las condiciones seguras y estandarizadas para
la toma de la muestra en cualquier laboratorio clnico. La sangre debe ser obtenida con
el anticoagulante etilendiaminotetraacetato (EDTA) o cido-citrato-dextrosa (ACD), para
ayudar a la separacin por centrifugacin de los glbulos blancos, los glbulos rojos y

el plasma. A pesar de que los glbulos blancos son una pequea poblacin de la sangre
total, se puede obtener alta cantidad de cidos nucleicos para el anlisis; en el caso del
ADN se puede encontrar una cantidad aproximada de 5 pg por clula y en 4 mL de
sangre perifrica hasta 100 g de ADN total, cantidad suficiente para realizar diferentes
pruebas. El plasma es otra fuente de ADN y ARN, provenientes de clulas muertas y
virus circulantes, los cuales pueden ser fcilmente aislados y analizados a partir de esta
muestra [20].
Otras muestras que pueden ser utilizadas para la obtencin de cidos nucleicos son las
gotas de sangre seca en papel filtro o absorbente [21], las cuales son utilizadas generalmente
en tamizajes del recin nacidos y en estudios que requieran ser remitidas a otras ciudades
o pases, o almacenadas por largos periodos de tiempo. En estos casos, la muestra es
tomada por puncin capilar en el dedo del paciente, saturando con sangre una zona
demarcada de un papel filtro y dejndola secar, el cual es empacado y sellado al vaco
y enviado al sitio de procesamiento. Los protocolos de aislamiento de alto rendimiento
y los equipos de anlisis, cada vez requieren menor cantidad de cidos nucleicos para
realizar las diferentes pruebas y abren un panorama amplio de posibles muestras a
analizar, donde los fluidos biolgicos como la orina, la saliva, el lquido cefalorraqudeo,
el semen, las secreciones vaginales, las heces fecales, entre otros, pueden ser utilizados
para la obtencin de cidos nucleicos de clulas nucleadas, patgenos o extracelulares
presentes en las muestras. Adems de los fluidos biolgicos, las muestras anatmicas
frescas, congeladas o fijadas por corto o largo tiempo pueden ser utilizadas para la
extraccin de material gentico, especialmente ADN, debido a que algunos factores como
el tiempo de procesamiento, la presencia de enzimas ribonucleasas, altas cantidades de
lpidos y carbohidratos, y la hemolisis pueden afectar la estabilidad del ARN, posterior a
la extraccin de la muestra [20].
Aislamiento de cidos nucleicos

Aislamiento de ADN
La extraccin del ADN inicia con la homogenizacin del tejido o lisis celular, dependiendo
de la muestra obtenida. Este primer paso est acompaado de detergentes y algunas
enzimas lticas que permiten la separacin de las clulas en el tejido, y el dao de la
membrana celular y nuclear para la liberacin del contenido celular, entre ellos las
protenas, el ADN y el ARN. Posteriormente, se utiliza la enzima proteinasa K para
separar los cidos nucleicos de las protenas y una ribonucleasa para eliminar el ARN; el
ADN es purificado con una solucin de fenol-cloroformo en columnas de silica o por una
precipitacin salina, para dejar en solucin el ADN celular o genmico [22]. El producto de
este procesamiento es precipitado con etanol y recuperado por centrifugacin, y el ADN
es resuspendido y cuantificado para determinar la concentracin obtenida (ver figura 5).
Aunque la extraccin manual es sencilla y permite obtener una alta calidad y cantidad
de ADN a bajo costo, la posibilidad de realizar el aislamiento de ADN automatizado,
utilizando columnas de silica o esferas magnticas, da un mayor rendimiento en el
procesamiento de mltiples muestras, evita errores de manipulacin y la contaminacin,
en las diferentes etapas del proceso. El rendimiento con el mtodo manual puede brindar

mayores concentraciones de ADN, no obstante, el ahorro de tiempo y las condiciones de

trazabilidad de las muestras, hace que los equipos automatizados sean preferidos para el
aislamiento en los laboratorios clnicos [22].
Purificacin Precipitacin
Homogenizacin Lisis del ADN Lavado del ADN
Figura 5. Procedimiento para el aislamiento y purificacin de ADN por el mtodo de fenol-cloroformo.
Aislamiento de ARN
Para el aislamiento del ARN se realiza un procedimiento similar al del ADN, pero bajo
condiciones estrictas de proteccin de las cadenas sencillas de ARN, las cuales son altamente
inestables y son degradadas fcilmente por ribonucleasas [22]. En el aislamiento de ARN
se debe asegurar una cadena de fro y la inhibicin de las ribonucleasas presentes en la
suspensin, el medio circundante y los elementos utilizados durante el procedimiento; para
esto, se debe limpiar el mesn, los reactivos, los elementos de proteccin y los equipos a
utilizar con inhibidores de ribonucleasas, presentes en las soluciones de homogenizacin
y de lisis celular. El mtodo basado en fenol junto con el isotiocianato de guanidino es el
ms utilizado en la actualidad; este mtodo permite purificar el ARN y posteriormente,
precipitarlo con etanol para ser resuspendido y cuantificado. Es importante mencionar que
el ARN total, en su gran mayora, est conformado por el ARN ribosomal y una pequea
parte corresponde al ARN de transferencia, el ARN mensajero y los ARN no codificantes. En
estuches comerciales se pueden encontrar protocolos especficos para el aislamiento de ARN
mensajeros que contengan la secuencia repetida de adeninas (colas de poli-A), las cuales se
unen a deoxitimidinas repetidas (poli-dT) que estn adheridas a una fase slida en el estuche.
Asimismo, se encuentran actualmente estuches que permiten aislar microARNs o ARN no
codificantes de 22 nucletidos de extensin, los cuales se han descubierto que tienen un rol
fundamental en diferentes procesos patolgicos [22].
Cuantificacin de cidos nucleicos

La cuantificacin de la concentracin del ADN y el ARN en las muestras procesadas se
puede realizar con un espectrofotmetro convencional. Actualmente existen en el mercado
espectrofotmetros que pueden realizar la cuantificacin de los cidos nucleicos en un
volumen de 0,5 L a 2 L de la muestra, sin necesidad de cubetas, a una longitud de onda de
260 nm; se utiliza adems la lectura a 280 nm para identificar la contaminacin de la muestra
con protenas (ver figura 6) [22]. A partir de la lectura a 260 nm se ha estimado que una
absorbancia corresponde a 50 g/mL de ADN, entonces el ADN (en g/mL) presente en una

solucin corresponde a 50 x A260, y la relacin entre A260/A280 con un valor > 1,8 da cuenta de
la pureza de ADN aislado. De la misma manera, a 260 nm, una absorbancia corresponde a 40
g/mL de ARN, de esta manera, el ARN (en g/mL) presente en la muestra es equivalente a
40 x A260, y la pureza del ARN con un valor >2 en la relacin A260/A280 [22].
Montaje Cuanticacin
Punta de
micropipeta Lmpara
de xenn
1 uL
de muestra
1 uL
de muestra
Detector
Detector
cidos nucleicos (ADN y ARN)

1.6 Contaminantes
1.4
1.2 Figura 6. Cuantificacin de cidos
Absorbancia
1.0 nucleicos por espectrofotometra.

0.8 Relacin de pureza: A. Sistema espectrofotomtrico de
0.6 ADN 260/280=1,8-2
ARN 260/280>2 cuantificacin de cidos nucleicos
0.4
(Nanodrop). B. Grfico de absor-
0.2
bancia que permite identificar la
0
220 240 260 280 300 320 340 pureza de los cidos nucleicos.
Longitud de onda
Almacenamiento y transporte de muestras

Los factores pre-analticos como el
almacenamiento y el transporte de las
muestras de ADN o ARN deben tener
las condiciones necesarias para evitar la Recipiente primario
degradacin, la contaminacin o contacto Material absorbente

con el medio externo, independiente si
las muestras son lquidas o slidas (papel
Recipiente secundario
filtro). El transporte de la muestra se debe
realizar en un contenedor doble, para que
si se compromete uno de los recipientes,
el segundo de ellos pueda evitar el dao Embalaje externo
o la contaminacin de la muestra. Si la
muestra es lquida debe estar envuelto en
un material que absorba todo el contenido y Figura 7. Condiciones ideales para el transporte de
evite derrames de la muestra en el ambiente muestras de sangre.
(ver figura 7). Las muestras deben tener toda
la informacin necesaria para identificar el paciente, la(s) prueba(s) a realizar, el rea del
laboratorio o el nombre y la direccin del laboratorio externo al que se dirige la muestra.
La temperatura de almacenamiento se debe conservar y evitar romper la cadena de fro, en
especial el ARN, el cual debe ser conservado por debajo de -20 C; el ADN aislado aunque es

mucho ms estable y puede ser almacenado a corto plazo a temperatura ambiente, se sugiere
que se conserve a 4 C en periodos cortos o por debajo de -20 C en periodos largos [20].
Amplificacin de cidos nucleicos

La evaluacin de una secuencia de ADN o ARN in vitro requiere de un mtodo de amplificacin
del cido nucleico blanco o especfico para obtener una cantidad de molculas que alcance el
lmite de deteccin necesario para la visualizacin o cuantificacin del ADN o ARN. Existen
diferentes mtodos para la amplificacin y evaluacin del ADN; esta revisin est enfocada
particularmente en la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (del ingls: Polymerase Chain
Reaction) y algunas de las variaciones realizadas a la tcnica hasta el momento. El objetivo
es poder identificar brevemente los principios que fundamentan la tcnica y las principales
condiciones analticas a tener en cuenta en la prctica clnica para la prevencin, apoyo
diagnstico y seguimiento de algunas enfermedades.
Reaccin en cadena de la polimerasa

Uno de los hitos histricos en el avance de la
biologa molecular fue el desarrollo de la reaccin
en cadena de la polimerasa, que en conjunto con
la tecnologa del ADN recombinante, ha sido
determinante en el cambio de visin de la biologa
celular a una biologa molecular, la cual poco a
poco ha venido impregnando la medicina [23].
La reaccin en cadena de la polimerasa utiliza el
mecanismo biolgico de la replicacin celular para
la duplicacin en serie de fragmentos especficos
de ADN (ver figura 8). La prueba utiliza un par
de cebadores sintticos que delimitan la regin
del ADN genmico a amplificar; y una vez
unidos de forma complementaria al ADN molde,
son reconocidos por la ADN polimerasa para Figura 8. Microscopia confocal de una clula can-
cergena en divisin. La fotografa muestra un
iniciar la replicacin de la cadena. La repeticin registro en el tiempo del proceso de replicacin
cclica de tres procesos basados en la temperatura celular donde se puede ver en azul la membrana
(desnaturalizacin, hibridacin y extensin), celular y en rojo el ADN. CIL: 41732 de Kuan-
Chung Su y Mark Petronczki.
junto con la adicin de desoxinucletidos y la
participacin de la ADN polimerasa, posibilita la sntesis de cadenas dobles complementarias de ADN
delimitadas por los cebadores; fragmento de ADN que ser amplificado de manera geomtrica hasta
alcanzar el nmero de copias deseado o llegar al punto final de la reaccin [24, 25].
Componentes de la
reaccin en cadena de la polimerasa
La reaccin en cadena de la polimerasa tiene una serie de componentes que son claves para el
adecuado desarrollo de la prueba (ver figura 9). En primer lugar es esencial tener un aislamiento

de ADN genmico del paciente o ADN de la muestra con una alta pureza, evitando al mximo
cualquier contaminacin cruzada con clulas externas, microorganismos o ADN libre, que pueda
generar la amplificacin de material gentico que no corresponda con el ADN de estudio y arrojar
resultados falsos positivos o resultados alterados. Los cebadores deben ser secuencias cortas de ADN
conocido, complementarios al ADN genmico que se desea amplificar, y diseados para ayudar a la
eficiencia de la prueba, evitar uniones inespecficas que darn resultados falsos positivos y prevenir
resultados falsos negativos debido a problemas en la eficiencia de la amplificacin. Para el adecuado
desarrollo de la prueba es necesario la adicin en exceso de desoxinucletidos trifosfatos (dNTPs)
de adenina, timina, citosina y guanina (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) para ser incorporados en las
nuevas cadenas de ADN, as como la solucin buffer apropiada para mantener el pH y aportar los
iones requeridos en el funcionamiento de la ADN polimerasa, la cual reconoce los cebadores unidos
de forma complementaria al ADN molde para iniciar la formacin de las cadenas hijas; el ADN
molde servir de plantilla para la adicin de los desoxinucletidos complementarios en el extremo
3 del cebador, a partir del cual ser extendido (ver figura 9, tabla 1).
Desnaturalizacin
Cromosomas
Cadena de ADN polimerasa

doble hebra
Deoxinucletidos Hibridacin
trifosfatos
Cadena hebra
sencilla A G T C
Cebadores Extensin
Figura 9. Componentes necesarios para el desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa. La

representacin esquemtica muestra el aislamiento de ADN de doble hebra, la mezcla del ADN con los
cebadores, los deoxincleotidos y la ADN polimerasa; as como las fases de desnaturalizacin, hibridacin
y extensin de las secuencias de nucleotidos en la reaccin.
Tabla 1. Componentes de una reaccin en cadena La protagonista de la reaccin en cadena

de la polimerasa
de la polimerasa es la enzima conocida
Tris-HCl, pH 8,3 10-50 mM
como taq ADN polimerasa, proveniente
Cloruro de magnesio 1,2 2,5 mM
de las bacterias termfilas Thermus aqua-
Cloruro de potasio 50nM
ticus descubiertas por Thomas Brock en
Deoxinucletidos trifosfatos 200 M cada uno
1969 en el parque nacional de Yellostone,
ADN polimerasa 0,5 5 UI Estados Unidos [26]. La capacidad de es-
Albumina srica bovina 100 g/mL tas bacterias de sobrevivir a temperaturas
Cebadores 0,1 10 M de 55 C a 80 C, gener un precedente en
ADN genmico 1 10 ng el desarrollo de la reaccin en cadena de

la polimerasa. Antes del descubrimiento, las hebras de ADN eran incubadas con los cebado-
res y replicadas por una ADN polimerasa proveniente de la bacteria Escherichia coli; sta en-
zima deba ser reemplazada cada nuevo ciclo de la prueba en el proceso de desnaturalizacin,
en el cual se separa la cadena doble de ADN a 95 C, debido a que esta temperatura tambin
afectaba a la enzima. En 1986, cientficos de la corporacin Cetus logran aislar la polimerasa
taq de la bacteria T. aquaticus, enzima que es activa a temperaturas de 70 C a 80 C y que
puede resistir temperaturas por encima de 95 C [27]. Gracias a la invencin del termociclador
en 1987 por Perkin-Elmer, aparato que realiza los ciclos de temperatura necesarios para la re-
plicacin del ADN de forma automtica, y al aislamiento de la enzima taq ADN polimerasa,
la reaccin en cadena de la polimerasa se pudo realizar en el mismo tubo y de manera auto-
matizada, sin procedimientos adicionales, lo que evita al mximo la contaminacin y mejora
considerablemente la eficiencia de la prueba [28].
Son muchos los cambios e innovaciones que se han realizado sobre la idea inicial de la reac-
cin en cadena de la polimerasa, pero en esencia se ha logrado mantener el principio funda-
mental de la prueba por ms de 30 aos [2]. Los avances en el desarrollo de enzimas que se
activan o inactivan a determinadas temperaturas, las mejoras en la fidelidad de la enzima
para evitar y corregir errores en la incorporacin de nucletidos, la velocidad en la formacin
de la copias de ADN, la incorporacin de otras enzimas para el paso de ARN a ADN, el uso de
mltiples cebadores para regiones diferentes o para delimitar una regin especfica, la adicin
de sondas fluorescentes para cuantificar la produccin de cadenas en tiempo real, el uso de
magnesio, dimetilsulfoxido, betaina, 7-deasa-GTP para mejorar la eficiencia de la reaccin,
son algunos de los avances realizados hasta el momento [24].
Diseo de cebadores para la secuencia blanco

La correcta seleccin del par de cebadores para la reaccin en cadena de la polimerasa es uno
de los principales determinantes para obtener un buen resultado en la tcnica. La especificidad
y complementariedad de los cebadores a la secuencia blanco es fundamental, no puede haber
hibridacin de los cebadores con ninguna otra secuencia en el genoma o entre ellos mismos,
se debe tener especial inters en evitar las secuencias repetidas o secuencias homlogas que
puedan interferir con la amplificacin producto de la unin de los cebadores en mltiples
sitios. El tamao de los cebadores debe ser entre 20 y 40 nucletidos, un tamao menor puede
tener mayor probabilidad de uniones inespecficas y un mayor tamao, puede disminuir la
eficiencia de unin [25, 29].
Otros dos factores importantes a tener en cuenta para el diseo de los cebadores es el
contenido de pares de nucletidos guanina citosina y adenina timina, y la influencia que
pueden tener en la temperatura de fusin (del ingls melting temperature) de los cebadores
[30]. Altos contenidos de guanina y citosina, as como cebadores muy largos, pueden alterar
la temperatura de fusin, definida como la temperatura a la cual la mitad de la doble hebra de
una secuencia est unida y la otra mitad separada, lo que reduce la eficiencia de la reaccin
ciclo tras ciclo y genera fallas en los resultados. Por esta razn, se recomienda que cada cebador
contenga un contenido de 45 % a 55 % de guanina-citosina y una temperatura de fusin igual
en los dos cebadores entre 55 C- 80 C [29, 30]. Actualmente existen herramientas informticas
para el diseo adecuado de los cebadores que permiten la bsqueda de secuencias en el
ADN que cumplan con las caractersticas ideales; asimismo, los estuches comerciales usados

para diagnstico molecular se han validado y cumplen con las condiciones ideales para el
reconocimiento de las secuencias blanco.
Ciclos de la reaccin en cadena de la polimerasa

Como ya se ha mencionado, la reaccin en cadena de la polimerasa es una va fcil y rpida
para copiar y amplificar pequeos fragmentos de ADN. Esta tcnica est basada en cambios
cclicos de temperatura que inducen: i) la desnaturalizacin o separacin de las cadenas de
doble hebra complementaria de ADN del paciente o muestra seleccionada, ii) la hibridacin o
unin de los cebadores a las hebras molde de cadena sencilla, y iii) la extensin, que corresponde
a la sntesis de la nueva cadena de ADN complementaria por la ADN polimerasa a partir
del cebador y usando el ADN molde como plantilla [1, 24]. La secuencia ininterrumpida de
estas tres fases en un termociclador, puede duplicar los fragmentos de ADN de hebra sencilla
presentes en la fase de desnaturalizacin, hasta lograr de miles a millones de copias de ADN
de doble cadena en la ltima fase de extensin en tan slo dos horas de procesamiento, hasta
alcanzar un efecto meseta (del ingls plateau) al final de la reaccin por agotamiento de los
reactivos (ver figura 10) [1].
ADN molde
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3
100
Desnaturalizacin
80
Extensin
Temperatura (C)
60
Hibridacin Figura 10. Ciclos de la reaccin

40 en cadena de la polimerasa. A.
Crecimiento exponencial de las
cadenas blanco de ADN y B.
20
Ciclos de temperatura y fases
de la reaccin en cadena de la
Ciclo 1 Ciclo 2
0 polimerasa.
Tiempo

La primera fase a la que son sometidas las muestras que contienen el ADN a analizar, es
la desnaturalizacin, la cual se realiza a una temperatura superior a 90 C para permitir
la desestabilizacin y separacin de los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las
bases nitrogenadas de la cadena doble de ADN, pero sin afectar los enlaces fosfodister
formados por los grupos fosfato con el azcar de desoxirribosa y que permiten la
integridad de la hebra sencilla (ver figura 10). En esta fase es necesario tener en cuenta que
la ADN polimerasa es termoestable y puede resistir la temperatura de desnaturalizacin
sin afectar la funcin de la enzima, y que las molculas de ADN presentes en la solucin
son separadas en hebras simples para exponer los sitios complementarios necesarios para
la unin de los cebadores especficos de la prueba que se vaya a realizar [1].
La segunda fase es la hibridacin o alineamiento de los cebadores con las hebras sencillas
de ADN presentes en la solucin o entre las hebras sencillas de ADN complementarias,
que forman as, cadenas de ADN sencillas con pequeas regiones de doble cadena donde
estn unidos los cebadores y cadenas dobles de ADN original. Para llevar a cabo este
paso, se debe reducir la temperatura a un rango de 40 C - 70 C para permitir la unin
de los cebadores con las regiones complementarias del ADN molde; en este punto, es
esencial conocer la temperatura de fusin de los cebadores, es decir, la temperatura a la
cual la mitad de la cadena se une a la contraparte complementaria (ver figura 10) [29] .
La temperatura de hibridacin es 5 C por debajo de la temperatura de fusin, y el rango
tan amplio de temperatura va a depender de los nucletidos que conforman la secuencia
[25]. Es importante recordar que la unin de los nucletidos adenina y timina requiere
de dos puentes de hidrogeno y por ende menor energa para la unin/separacin de
estas uniones, contrario a los nucletidos citosina y guanina que forman tres puentes
de hidrogeno y con ello una demanda de mayor energa; una alta cantidad de citosina y
guanina en la secuencia representa una temperatura de fusin y de hibridacin alta [25].
La tercera fase del ciclo es conocida como la extensin o elongacin, este nombre se debe al
proceso que realiza la ADN polimerasa, que reproduce el proceso de duplicacin del material
gentico que se lleva a cabo en las clulas para la replicacin celular (ver figura 10). La enzima
termoestable taq ADN polimerasa, o actualmente la pfu ADN polimerasa (aislada de la
Archaea Pyrococcus furiosus, y que produce menor cantidad de errores en la secuencia),
est encargada de generar una hebra de ADN complementaria de una regin especfica
de ADN en direccin 5 3, a partir de los extremos 3 libres de los dos cebadores o
iniciadores que estn unidos a las hebras molde del ADN original, para obtener copias
exactas de hebras de cadena doble del fragmento seleccionado [27]. A modo de ejemplo,
podemos asumir que los cebadores se disean para unirse en direccin 35 en el inicio
de la secuencia blanco y 53 al final de la secuencia complementaria, de esta forma se
asegura que la extensin que realiza la ADN polimerasa, a partir de los extremos 3 en
ambos cebadores, genera una secuencia complementaria slo de la regin de inters. La
temperatura ms utilizada a la que se realiza esta fase es a 72 C, dado a que la actividad
ptima de la enzima es de 75 C a 80 C; el uso de esta temperatura permite que algunos
protocolos slo utilicen dos temperaturas, una para la desnaturalizacin y otra para la
hibridacin y extensin, lo que mejora la eficiencia de la prueba [31].

Tabla 2. Crecimiento exponencial de ADN en la La reaccin en cadena de la polimerasa

reaccin en cadena de la polimerasa est basada en la repeticin continua
Ciclo de PCR Cantidad de secuencias de 20 a 40 ciclos de las tres fases, cada
1 2 una aproximadamente de un minuto:
2 4 desnaturalizacin (> 90 C), hibridacin (40
3 8 C 70 C) y extensin (72 C) (ver figura
4 16 10); que duplica de forma exponencial el
5 32 nmero de cadenas iniciales de ADN de
6 64
doble hebra para la identificacin en su
punto final. Posterior a la amplificacin de
7 128
la secuencia del ADN blanco se corrobora
8 256
la presencia o ausencia de la molcula de
9 512
ADN por diferentes mtodos, siendo el ms
10 1.204
utilizado la electroforesis en gel de agarosa.
20 1.048.576
El nmero de secuencias duplicadas es
30 1.073.741.824 determinante para la visualizacin del
40 1.099.511.627.776 ADN en un gel de agarosa, al igual que la
presencia de un compuesto fluorescente
que se intercale entre las pares de bases de la secuencia de ADN. Para visibilizar el ADN en un
gel de agarosa debe tener una cantidad mnima de 1012 pares de bases, proporcin que puede
ser obtenida tras 40 ciclos de una sola secuencia de ADN [24, 25] (ver tabla 2). La reaccin en
cadena de la polimerasa puede ser realizada en microviales, microplacas, capilares o tarjetas
de microfluidos, que pueden procesar desde 24 hasta 380 muestras en paralelo dependiendo
del equipo utilizado. El volumen final de la solucin, con los componentes necesarios para
realizar la prueba, puede variar de 25 a 100 L por paciente o muestra.
Deteccin de cidos nucleicos

Electroforesis en gel
Uno de los mtodos ms utilizados para el anlisis de los productos de punto final obtenidos en
la reaccin en cadena de la polimerasa es la electroforesis en gel. Este mtodo permite separar
en el gel tanto ADN, como ARN y protenas, teniendo como base la carga elctrica, el tamao
y el punto isoelctrico de cada molcula (ver figura 11). De acuerdo al tamao del ADN blanco
a identificar, especficamente para el obtenido por la reaccin en cadena de la polimerasa, se
usa un gel de agarosa o de poliacrilamida; el primero de utilidad para cadenas largas de ADN
(50 - 20.000 pares de bases) y el segundo para cadenas cortas (5-500 pares de bases) [1]. La
electroforesis consiste en la migracin de una molcula ionizada y con carga neta (presente en el
gel) tras aplicar un campo elctrico generado en una cmara que posee un nodo (polo positivo)
y un ctodo (polo negativo) en lugares opuestos, los cuales atraern las molculas segn su carga
contraria. A medida que las molculas migran, la red de poros de diferente tamao presentes en
el gel limita la velocidad de migracin de las molculas ms grandes y facilita o acelera el paso
de las molculas de menor tamao. Dependiendo del tiempo de la electroforesis y el tipo de gel,
se obtiene un patrn de migracin donde las molculas ms grandes estn cerca del ctodo y las
ms pequeas en el extremo del nodo (ver figura 11) [1].

ADN producto de la reaccin

en cadena de la polimerasa
Ctodo Molculas
ADN de tamao grandes
conocido
utilizado como
plantilla Molculas
pequeas
nodo
Gel Solucin de
pH neutro
Figura 11. Electroforesis en gel. A. Representacin esquemtica de la electroforesis en gel y B. Gel

de Electroforesis de campo pulsado (PFGE) teido con bromuro de etidio de diferentes aislamientos
clnicos de Staphylococcus aureus provenientes de una institucin hospitalaria. Cortesa de la Lnea de
investigacin de Epidemiologa Molecular Bacteriana del grupo de Microbiologa Molecular y el grupo
de investigacin en Microbiologa Bsica y Aplicada (MICROBA), de la Escuela de Microbiologa de la
Universidad de Antioquia.
El ADN en una solucin de pH neutro tiene una carga negativa y es atrada por cargas
positivas, lo que produce su migracin en el gel desde el ctodo hacia el nodo. El ADN
blanco, que ha sido duplicado por la reaccin en cadena de la polimerasa, migra en una regin
del gel de acuerdo a la cantidad de pares de bases que tiene la secuencia, y es acumulada en
una banda que se ubica en paralelo a una de las bandas de tamao determinado de un patrn
comercial que contiene ADN de diferentes longitudes y que es corrido de forma simultnea
a la muestra; esto, permite determinar el tamao (peso) de la secuencia estudiada en pares de
bases. Para visualizar el ADN blanco separado se utilizan agentes luminiscentes o colorantes
como el bromuro de etidio, RedGel, azul de metileno, Blue View, entre otros compuestos, que
pueden unirse al ADN de doble cadena y generar una seal lumnica que es directamente
proporcional a la cantidad de ADN presente [24, 25]. La presencia o ausencia de una banda
de ADN en un peso determinado, as como el cambio en la migracin de una secuencia por
mutaciones, deleciones o adiciones en el ADN en comparacin a un patrn de migracin, es
el resultado cualitativo de mayor uso en el anlisis de la reaccin en cadena de la polimerasa.
Tambin es posible obtener resultados semicuantitativos al evaluar la seal lumnica por
densitometra y extrapolar la cantidad de ADN presente en una banda especfica, con relacin
a una curva estndar realizada con diferentes concentraciones de ADN [32].
Reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa

A pesar que la electroforesis en gel ha sido el mtodo ms usado para el anlisis de los
productos de la reaccin en cadena de polimerasa de punto final, en 1992 se consigue realizar
la amplificacin y anlisis de los productos en el mismo tubo de forma cuantitativa y en tiempo
real, lo que reduce el tiempo de procesamiento, las fuentes de error y de contaminacin que
se pueden dar durante la electroforesis, y permite obtener resultados mucho ms precisos,
exactos y reproducibles [33, 34]. La reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real o
cuantitativa, como se conoce actualmente, ha ganado un gran reconocimiento en el rea clnica
al usar el principio base de la reaccin en cadena de la polimerasa, pero adems, incluir la
lectura de una seal fluorescente para identificar y cuantificar en tiempo real la reproduccin
de cadenas dobles de ADN ciclo tras ciclo [35]. Las aplicaciones de la reaccin en cadena de

Tabla 3. Fluoroforos empleados en tcnicas mole- la polimerasa cuantitativa en la prctica

culares clnica son diversas y se ha logrado
Fluoroforo Excitacin Emisin consolidar plataformas y estuches
(Longitud de (Longitud de
onda) onda) comerciales para la discriminacin de
Cascada blue 375 423 mutaciones puntuales en enfermedades
YOY-1 491 509 genticas, variantes oncognicas,
BODIPY-FL 503 512 polimorfismos de nucletidos simples,
metilacin de ADN, nmero de copias de
Fluoresceina (FITC) 495 519
ADN o ARN (carga viral), identificacin
SYBR Green I 497 520
de microorganismos, entre otras
TOTO-1 509 533
aplicaciones en desarrollo [2, 31, 36-43].
FAM 495 535
TET 522 550 La cuantificacin de cidos nucleicos en
JOE 525 555 la reaccin en cadena de la polimerasa
Cy3 552 565 cuantitativa est basada en la fluorescencia,
POPO-3 534 570 definida como un tipo de emisin de
Rodamina 540 570 luz caracterizada por la absorcin de
NED 553 575 radiacin electromagntica de onda corta
TAMRA 560 580
como la luz ultravioleta, para la posterior
emisin de esa energa en una longitud
Naranja de acridina 460-502 526-650
de onda ms larga, particularmente en el
Cy5 643 667
espectro de luz visible. Los fluorforos o
Red 670 480-565 670
fluorocromos son compuestos que tienen
Bromuro de etidio 526 605
la capacidad de generar fluorescencia
ROX 580 605
en todo el espectro visible cuando
Red 613 480-565 613 son excitados a una longitud de onda
Rojo de Texas 596 615 especfica, ampliamente utilizados en
H o m o d i m e r o d e 534 616 el laboratorio clnico (ver tabla 3) [24].
etidio
A diferencia del mtodo tradicional, en
Yoduro de propidio 536 617
la reaccin en cadena de la polimerasa
IRD 700 685 705
cuantitativa, se adiciona al inicio de la
Cy7 743 767
reaccin un compuesto fluorescente que
IRD 800 795 849 se una a las cadenas dobles de ADN, de
Tomado de [26] forma inespecfica o especfica, y genere
una seal fluorescente en tiempo real
proporcional al nmero de cadenas de doble hebra que se forman en cada ciclo [34].
La reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa mide la fluorescencia emitida por los

fluorforos en la fase de hibridacin o de extensin en cada ciclo a medida que la amplifi-
cacin progresa (ver figura 12). Esto permite cuantificar la amplificacin de la hebra molde
durante la fase exponencial de la prueba, antes de llegar a un agotamiento de los reactivos,
a la acumulacin de los inhibidores o la inactivacin de la polimerasa, como sucede en el
mtodo tradicional [25]. Los grficos que proporciona el software para el anlisis, relacionan
la intensidad de fluorescencia frente al nmero de ciclos y permite hacer una correccin de
la fluorescencia inespecfica para generar un lmite de deteccin y un valor umbral, que se
estima por encima del lmite de deteccin, para la identificacin de la fluorescencia especifica

asociada a la generacin de ADN de doble hebra (ver figura 12). El nmero del ciclo en el
cual la fluorescencia de una muestra especifica cruza el umbral es conocido como el ciclo de
cuantificacin (Cq, del ingls quantification cycle, tambin conocido como threshold cycle (Ct),
crossing point (Cp) y take-off point (TOP)), cuyo valor tiene una relacin inversamente propor-
cional a la concentracin inicial de la muestra. Entre mayor sea la concentracin de ADN en
el inicio de la reaccin, la fluorescencia se podr identificar en un ciclo menor, dando un valor
del ciclo de cuantificacin ms bajo [25].
Alta concentracin de ADN

0.9 Baja concentracin
de ADN
Fluorescencia
Fluorescencia basal
Fluorescencia
Figura 12. Esquema de un grfico de Umbral

0.6 fluorescencia vs. nmero de ciclos Lmite de
de tres muestras de ADN diferentes, Ciclo de deteccin
que permite identificar el inicio de la cuanticacin
reaccin, el lmite de deteccin de la Muestra 1

0 fluorescencia, el valor umbral y los
Muestra 2
10 15 ciclos 20
de cuantificacin
25 30de cada una
de las muestras. Muestra 3
Tiempo Cq1 Cq2 Cq3
Tiempo (nmero de ciclo)
La reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa puede generar datos absolutos o relativos

de acuerdo a la aplicacin o resultado que se requiera. En la cuantificacin absoluta, la
fluorescencia producida por la muestra permite calcular el nmero de copias exactas, al
relacionar el valor del ciclo de cuantificacin de la muestra con los valores de concentraciones
conocidas en una curva estndar (ver figura 13). Por su parte, la cuantificacin relativa permite
identificar el aumento o disminucin del ADN o ARN presente en la muestra de acuerdo
al ciclo de cuantificacin y con base en un control de expresin constante, que permite la
comparacin con otras muestras. Tambin es importante mencionar que la reaccin en cadena
de la polimerasa cuantitativa permite reemplazar el anlisis cualitativo o semicuantitativo
de la electroforesis en gel, e identificar la presencia o ausencia de una secuencia de ADN
o sus variantes (mutaciones) al analizar la temperatura de fusin a la cual se da, se pierde o se
gana la emisin de fluorescencia [24, 35]. Este anlisis se realiza con una curva de disociacin
donde se grafica la intensidad de fluorescencia y el tiempo contra la temperatura (ver figura 14),
es importante recordar que la temperatura de fusin es la temperatura a la cual la mitad de
una cadena doble de ADN est unida y la otra mitad separada; cada secuencia posee una
temperatura de fusin especfica de acuerdo al tamao, la complementariedad y al contenido
de guanina-citosina y de adenina-timina, que permite identificar si durante la prueba hay
amplificacin de una cadena o de varias secuencias diferentes como es el caso de mutaciones
especficas (ver figura 14) [24, 30].
Para realizar una adecuada evaluacin de la formacin de las cadenas de doble hebra, por
cuantificacin relativa, cuantificacin absoluta o el anlisis de la temperatura de fusin; se
debe tener en cuenta el tipo de fluorforos utilizados y el mecanismo usado para identificar la
secuencia de ADN de doble cadena. La unin de los fluorforos y la emisin de fluorescencia
puede ser inespecfica o especfica, como se haba mencionado anteriormente, teniendo una

mayor sensibilidad y especificidad, el uso de sondas dirigidas a la secuencia blanco. En el

caso de la interaccin inespecfica, se presenta una activacin del fluorforo dependiente de
la unin al ADN de cadena doble, como el SYBR-green, Eva-green o el bromuro de etidio,
pero que no obedece a una secuencia especfica de nucletidos para la unin; este tipo de
interaccin puede generar falsos positivos o interferir con los resultados por la presencia de
contaminantes o la hibridacin inespecfica a otras secuencias (ver figura 15) [24]. Las sondas,
por el contrario, estn conformadas por secuencias de nucletidos especficos que hibridan
exclusivamente con el ADN blanco en una secuencia especfica, y que pueden o no ser parte
de los cebadores utilizados para la amplificacin. A diferencia de los fluorforos de unin
inespecfica, pueden requerir de la accin de la ADN polimerasa para la emisin de luz
visible; estn conformadas por dos molculas fluorescentes o una molcula fluorescente y un
inactivador, y se dividen, segn el mecanismo de accin, en sondas de hidrolisis o sondas de
hibridacin (ver figura 15) [24, 25].
Copias de ADN
100 1,000,000
Cilco de cuanticacin 40
100,000
35
Fluorescencia
10,000
1,000
50 100 30
10
1
25
Cilco de
0 20
0 cuanticacin
10 20 30 40 50 60 100 102 104 106

Nmero de ciclos ADN molde (nmero de copias)
Figura 13. Cuantificacin absoluta para la reaccin en cadena de la polimerasa. A. Grfico de fluorescencia
vs nmero de ciclos que permite identificar el ciclo de cuantificacin de muestras con diferentes
concentraciones de ADN molde y B. Grfico de nmero de ciclos vs ADN molde que permite identificar
la curva estndar para la cuantificacin de muestras desconocidas.
Sondas de hidrolisis e hibridacin

Uno de los principios en los que se basa el funcionamiento de las sondas utilizadas en la
reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa es la transferencia de energa por resonancia
de fluorescencia (FRET, del ingls fluorescence resonance energy transfer). Este fenmeno
fsico ocurre slo cuando hay una interaccin a muy corta distancia de dos fluorforos o un
fluorforo con un inactivador (del ingls quencher), donde uno de los fluorforos (donador)
al absorber una longitud de onda especfica emite en otra longitud de onda, que puede
activar al fluorforo cercano (receptor), o en el caso del inactivador, ser absorbida para evitar
la emisin de luz [44]. Las sondas de hibridacin dual Hybprobe tienen dos fluorforos que
realizan transferencia de energa a corta distancia y las sondas de hidrolisis como las Taqman,
Molecular beacons y las Scorpion, utilizan un fluorforo y un inactivador que evita la emisin de
luz dependiendo de la distancia mediante desactivacin dinmica o, mientras se encuentren
unidas, por desactivacin esttica o por contacto.

7
Mutado
5 Normal
Tiempo
40 50 60 70 80 90 Factor V Leiden
Temperatura (C) Homocigotico WT
Normal Mutado 0.25 Homocigotico mutante
Heterocigotito mutante
0.20
40
Fluorescente
dFjdT
35 0.15
30 0.10
0.05
40 50 60 70 80 90
Temperatura (C) 0
45 50 55 60 65 70
Normal Mutado Temperatura (C)
0.8
dFjdT
0.4
40 50 60 70 80 90
Temperatura (C)
Figura 14. Anlisis de la temperatura de fusin. A. Grfico del tiempo vs la temperatura a la cual se
asocia y disocia una secuencia normal y otra mutada en el mismo anlisis, y B. Grfico de la fluorescencia
vs la temperatura, donde se muestra la perdida de fluorescencia a medida que aumenta la temperatura
y C. Grfico de la diferencia de la fluorescencia en relacin con la diferencia del tiempo (dF/dT) vs la
temperatura, para obtener la curva de disociacin para el anlisis de la temperatura de fusin. D. Anlisis
de los genotipos homocigtico y heterocigtico del gen factor V de Leiden en una curva de disociacin.
Las sondas de hibridacin dual Hybprobe son dos cadenas de nucletidos, diferentes a los
cebadores, utilizadas en la reaccin, donde una sonda lleva un fluorforo donador en el
extremo 3 y la otra sonda lleva un fluorforo receptor en el extremo 5 (ver figura 15).
Ambas sondas se hibridan en la secuencia blanco de forma especfica y en una regin
contigua una de la otra. Dependiendo de la cercana de ambos fluorforos se genera una
transferencia de energa, por resonancia de fluorescencia, que al activar el fluorforo
donador con una luz externa excita el fluorforo aledao para inducir una seal
lumnica cuantificable y especfica, que depender de la presencia o no de mutaciones o
polimorfismos que afecten la distancia de ambos fluorforos (ver figura 15) [24, 45]. Este
tipo de sondas permite identificar de forma especfica las secuencias blanco, debido a la
presencia de cuatro sondas que requieren hibridarse para amplificar la secuencia blanco
y generar una seal en cada uno de los ciclos.
Las sondas Taqman son cadenas de 20 a 30 nucletidos que hibridan en la secuencia blanco
en ambas cadenas y que no estn asociados a los cebadores; estos, tienen un fluorforo
en el extremo 5 y un inactivador en el extremo 3 que evita la emisin de luz mientras
la secuencia se mantenga intacta (ver figura 15). Posterior a la desnaturalizacin, la

sonda Taqman se hibrida con la secuencia de ADN blanco en la regin que delimitan
los cebadores, para luego ser eliminada en la fase de extensin gracias a la actividad
exonucleasa o de remocin de nucletidos, que posee la ADN polimerasa en el proceso de
formacin de la cadena de doble hebra. La remocin cada nucletido de la sonda Taqman
unido a la secuencia blanco, lleva a que el fluorforo y el inactivador sean separados, lo
que permite que el fluorforo pueda emitir una seal de luz visible, que est relacionada
con el nmero de cadenas de doble hebra generadas en cada ciclo (ver figura 15) [24, 44].
SYBR green
+
Fluoroforo inespecco
Hybprobe
Fluoroforo Fluoroforo
Sondas Taqman
+
Fluoroforo Inactivador
Sondas Beacon
+
Fluoroforo Inactivador
Sondas Scorpion
Fluoroforo Fluoroforo
Inactivador Inactivador
Figura 15. Fluorforos y sondas fluorescentes para el seguimiento de la reaccin en cadena de la

polimerasa cuantitativa.
Por su parte, las sondas Molecular beacons son cadenas de nucletidos que presentan una
estructura de tallo-bucle o horquilla de cabello, donde los seis ltimos nucletidos de
cada extremo de la secuencia son complementarios entre s y forman una cadena doble
que se conoce como el tallo y una regin central no complementaria en forma de bucle
(ver figura 15). El fluorforo y el inactivador se encuentran en los extremos 5 y 3 al
igual que las sondas Taqman, lo que evita la emisin de luz, por desactivacin esttica

o desactivacin por contacto, mientras la estructura tallo-bucle est formada. La regin

central o el bucle de la sonda tiene una alta complementariedad por la secuencia de ADN
que se va a amplificar, unindose a la hebra molde en la fase de hibridacin slo si es
totalmente complementaria; la presencia de un slo nucletido no complementario en
la cadena blanco lleva a que se prefiera la formacin de la estructura de tallo-bucle y no
la hibridacin con la secuencia a amplificar. La unin de la sonda con el ADN permite
que se separe el fluorforo presente en el extremo 5 del inactivador que se encuentra
en el extremo 3, lo que lleva a una emisin de luz mientras la sonda permanezca unida
al ADN (ver figura 15) [24, 44]. La sonda es removida de la cadena molde en la fase
de extensin, volviendo a la conformacin de tallo bucle y quedando funcional para un
nuevo ciclo. La ventaja en el uso de est sonda es la posibilidad de utilizar sondas con
diferentes fluorforos que presenten variaciones mnimas para diferenciar la presencia de
polimorfismos de un slo nucletido.
Por ltimo, las sondas Scorpion estn incorporadas en los cebadores especficos de la
reaccin, poseen la misma estructura tallo-bucle de las sondas Molecular beacons, tienen
el fluorforo en el extremo 5 y el inactivador en el extremo 3, que evita la emisin
de luz por el mecanismo de desactivacin esttica, pero, se diferencia en que en el
extremo 3 se adiciona el cebador a la secuencia de la sonda (ver figura 15). La fusin
del cebador con la sonda evita la adicin de una secuencia adicional a la prueba, y
da una mayor velocidad y sensibilidad a la reaccin [24, 44]. Durante el proceso, el
cebador se une a la regin blanco, lo que permite que se d la extensin de la cadena
complementaria sin afectar la conformacin de la sonda. En el ciclo siguiente, la sonda
se desnaturaliza e hibrida en las cadenas nuevas formadas; ya no slo se une el cebador
por complementariedad sino tambin la regin que forma el tallo-bucle de la sonda,
alejando de esta manera el fluorforo del inactivador y permitiendo la emisin de luz,
que ser proporcional al nmero de molculas presentes en cada ciclo (ver figura 15). La
sonda es desplazada al completar cada ciclo de extensin, y reciclada para ser utilizada
en el siguiente ciclo.
Utilidad clnica de la reaccin

en cadena de la polimerasa cuantitativa
El uso de la biologa molecular, en este caso la reaccin en cadena de la polimerasa, es
una herramienta esencial para la toma de decisiones en todas las etapas de la atencin
del paciente: la evaluacin del riesgo, la deteccin, el diagnstico, la estadificacin y el
pronstico, la seleccin de la terapia, y el seguimiento en diferentes enfermedades (ver
tabla 4). Actualmente hay muchos marcadores moleculares que se usan en la prctica
mdica, que aumentan da tras da a medida que se comprende la enfermedad desde
la biologa celular y molecular. En esta apartado, se mostrarn algunos ejemplos
del diagnstico molecular segn las etapas de la atencin del paciente, que van a ser
ampliamente detallados en otras entregas del mdulo de biologa molecular de la revista
Medicina & Laboratorio, y que sin lugar a dudas, la comprensin de los principios que
las fundamentan y la utilidad clnica de cada una de ellas, van a hacer una diferencia
fundamental en la atencin al paciente, lo que generar nuevos desenlaces.

Tabla 4. Utilidad clnica de algunos marcadores moleculares
Evaluacin Tamizaje Diagnstico Seleccin de la Seguimiento

de riesgo terapia
Gen BRCA1 Virus del papiloma Gen HFE Gen BRAF Gen de fusin
humano BCR-ABL
Gen HFE Gen HFE Bacteria Gen KRAS Carga viral
Gen Factor V de Resistencia Hongos Gen Her/Neu2 CBFB/MYH11

Leiden bacteriana
Gen protrombina Virus Resistencia

bacteriana
Gen Septina 9 Gen de fusin

metilado BCR-ABL
Gen BCL1/BCL2
Inversin CBFB/
MYH11
Evaluacin de riesgo
Gen BRCA1
BRCA1 y BRCA2 son genes humanos que producen protenas supresoras de tumores.
Estas protenas ayudan a la reparacin del ADN daado y, por tanto, desempean un
papel esencial en asegurar la estabilidad del material gentico de la clula. Cuando
uno de estos genes est mutado o alterado de forma que la protena que origina no
se produce o no funciona correctamente, el dao del ADN no puede ser reparado
adecuadamente; como resultado, las clulas estn propensas a desarrollar alteraciones
genticas adicionales que pueden conducir al cncer. Mutaciones heredadas especficas
en los genes BRCA1 y BRCA2 aumentan el riesgo de cncer de mama femenino y de
ovario, y se han asociado con un mayor riesgo de varios tipos adicionales de cncer [42,
43, 46], por lo que su deteccin temprana permite evaluar el riesgo de un paciente de
presentar la enfermedad.
Factor V Leiden y Protrombina II

Las mutaciones en los genes del factor V Leiden y de la protrombina son los factores de
riesgo gentico ms frecuente para la trombosis venosa. La alteracin de las protenas
asociadas a estos genes puede provocar estados de hipercoagulacin. Estos genes pueden
ser evaluados en individuos que tienen antecedentes mdicos de trombosis venosa
o en familias en las que existe una alta incidencia de la enfermedad. La identificacin
de portadores permite tomar medidas de prevencin en individuos que presenten la
mutacin cuando estn sometidos a situaciones de riesgo como el embarazo, tratamiento
con anticonceptivos, inmovilizaciones prolongadas, o para determinar el riesgo de infarto
de miocardio [24, 47].

Tamizaje
Virus del papiloma humano
Hace unos 20 aos, los investigadores descubrieron la relacin entre el virus del papiloma
humano (VPH) y el cncer de cuello uterino. Ahora se sabe que de los 100 o ms tipos
genticamente distintos del virus, unos 14 estn asociadas con alto riesgo de cncer de cuello
uterino, y que slo ocho de ellos son responsables de casi todos los casos. Debido a que los
tipos de virus del papiloma humano son identificables por mtodo moleculares, ha sido
posible desarrollar pruebas para tamizaje de mujeres infectadas con los tipos de alto riesgo.
La identificacin de las mujeres con alto riesgo de padecer cncer permite una adecuada gua
en el seguimiento, lo que facilita la interpretacin cuando los resultados de una citologa
cervico-vaginal convencional (prueba de Papanicolaou) no son concluyentes. La Sociedad
Americana del Cncer y otras sociedades profesionales lderes, recomiendan que las mujeres
entre 21 y 65 aos de edad deben recibir una prueba de Papanicolaou (u otra forma de prueba
citolgica) cada tres aos, y las mujeres 30 a 65 aos de edad, deben recibir adems de la
prueba citolgica, una prueba de virus del papiloma humano cada cinco aos [48].
Evaluacin de riesgo, tamizaje y diagnstico

Hemocromatosis
La hemocromatosis hereditaria es reconocida como un trastorno autosmico recesivo,
asociado al gen HFE (inicialmente llamado HLA-H), el cual produce una protena similar a
una protena del complejo mayor de histocompatibilidad clase I, pero que no se une ni presenta
pptidos endgenos, y no se cree que tenga una funcin inmunolgica. Se ha descrito que la
protena HFE interacta con el receptor de la transferrina y modula la absorcin intestinal
de hierro en la dieta. Las mutaciones en HFE interfieren con esta funcin reguladora, lo que
lleva a un exceso de la absorcin del hierro y su almacenamiento en los tejidos. La evaluacin
molecular de las mutaciones de la protena HFE puede servir para el tamizaje, el diagnstico
y el seguimiento de pacientes con alteraciones en el metabolismo del hierro [49, 50].
Diagnstico y seguimiento
Enfermedades infecciosas
A medida que las tcnicas moleculares son aceptadas y adaptadas en la comunidad
mdica, ms y ms microorganismos se detectan o caracterizan por mtodos moleculares,
convirtindose poco a poco en la prueba estndar, especialmente para microorganismos
que son difciles de cultivar o cuando se necesita un cultivo posterior para la identificacin
de resistencia a los medicamentos. Adems, los mtodos moleculares cuantitativos se han
convertido en una ayuda imprescindible para el seguimiento en respuesta a la terapia,
especialmente en pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el
virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C. Otros microorganismos que pueden ser
evaluados actualmente por estas tcnicas son: parvovirus humano B19, virus Epstein-Barr,

Toxoplasma gondii, citomegalovirus, virus herpes humano, Mycobacterium tuberculosis, entre

otros [24, 42, 51, 52].
Seguimiento
K-ras, N-ras, B-raf y Her2/neu
Los protooncogenes K-ras, N-ras, B-raf y Her2/neu, son genes que desempean papeles
crticos en la divisin, la diferenciacin y la autodestruccin celular. Mutaciones en estos
genes producen protenas anmalas asociadas a la formacin de neoplasias en el pncreas,
el colon, el recto, el pulmn y otros tejidos del cuerpo. Actualmente se utiliza la deteccin de
mutaciones especficas en estos genes para determinar la idoneidad del paciente para ciertas
terapias en cncer colorrectal y de pulmn [36, 53, 54]. Estas pruebas moleculares hacen
parte de un nmero creciente de ejemplos de diagnstico molecular que ayuda a la toma de
decisiones de un mdico sobre el tratamiento adecuado del cncer.
Conclusiones
La biologa molecular ha logrado generar rupturas en la forma de concebir la ciencia,
pasando de una visin reduccionista, mecanicista y teleolgica para la explicacin biolgica,
a la bsqueda de conocimiento y herramientas que nos permitan generar aproximaciones
complejas, sistmicas y con una mirada holstica de los organismos, teniendo en cuenta cada
nivel de interpretacin (molecular, celular y tisular) y las relaciones que lo componen. Debido
a la complejidad de las enfermedades, hay un nmero cada vez mayor de biomarcadores
moleculares que son validados clnicamente para diferenciar a los subgrupos de poblaciones
que tienen sntomas y cursos clnicos variables en la misma enfermedad. Las nuevas
tecnologas estn haciendo posible recopilar diferente informacin para caracterizar el estado
de la enfermedad, el desarrollo de mejores alternativas de tratamiento para un paciente o en
el caso de las enfermedades infecciosas, la identificacin rpida de un patgeno especfico. La
aplicacin prctica de estos mtodos puede ser un gran reto debido a la complejidad de las
tecnologas involucradas, pero estos desafos estn siendo soportados por la integracin de
mtodos moleculares con tecnologas de la informacin y de anlisis de datos a gran escala.
Los errores y aciertos del estudio del genoma humano han permitido el impulso vertiginoso
del desarrollo de las micas y la biologa de sistemas como herramientas tericas e
instrumentales para la interpretacin de la complejidad del ser humano. La medicina de
laboratorio en conjunto con la biologa molecular empieza a asumir el reto de generar nuevos
desenlaces ante una forma diferente de ver el proceso de la salud y la enfermedad, a su vez
que da respuestas complejas ante los desafos que durante siglos han sido incgnitas para
la medicina. La biologa molecular y la medicina introduce un conjunto de herramientas al
laboratorio clnico que dan informacin rpida y precisa sobre la estructura molecular (ADN
y ARN) de un paciente o muestra en particular, la cual puede ser utilizada para la prevencin,
diagnstico y tratamiento de muchas enfermedades de base gentica o enfermedades
complejas. La introduccin de la genmica por medio de la secuenciacin y el acceso paulatino
de otras micas en el laboratorio clnico abren un portafolio de posibilidades inimaginables
para la medicina del siglo XXI.

Bibliografa
1. Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, 16. Esteller M. Non-coding RNAs in human di-
Bretscher A, Ploegh H, et al. Molecular Cell sease. Nat Rev Genet 2011; 12: 861-874.
Biology (ed 7). New York: W. H. Freeman and
17. Tyers M, Mann M. From genomics to proteo-
Company; 2012.
mics. Nature 2003; 422: 193-197.
2. Katsanis SH, Katsanis N. Molecular genetic
18. Caie PD, Schuur K, Oniscu A, Mullen P, Rey-
testing and the future of clinical genomics.
nolds PA, Harrison DJ. Human tissue in sys-
Nat Rev Genet 2013; 14: 415-426.
tems medicine. FEBS J 2013; 280: 5949-5956.
3. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of
19. Kitano H. Computational systems biology.
nucleic acids; a structure for deoxyribose nu-
Nature 2002; 420: 206-210.
cleic acid. Nature 1953; 171: 737-738.
20. Hengesbach L, Gerlach JA. Specimen Co-
4. Jackson DA, Symons RH, Berg P. Biochemi-
llection, Handling, and Processing. In: Hu P,
cal method for inserting new genetic infor-
Hedge MR, Alan P, eds. Modern Clinical Mo-
mation into DNA of Simian Virus 40: circu-
lecular Techniques. New York, US: Springer;
lar SV40 DNA molecules containing lambda
2012: 3-10.
phage genes and the galactose operon of Es-
cherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 1972; 21. Lahiri DK, Schnabel B. DNA isolation by a
69: 2904-2909. rapid method from human blood samples:
effects of MgCl2, EDTA, storage time, and
5. Arnheim N, Erlich HA, Horn GT, Mullis
temperature on DNA yield and quality. Bio-
KB, Saiki RK, Scharf SJ. Process for ampli-
chem Genet 1993; 31: 321-328.
fying, detecting, and/or-cloning nucleic acid
sequences. United States of America: Cetus 22. Wang H. DNA/RNA Isolation and Quan-
Corporation; 1987. titation. In: Hu P, Hedge MR, Alan P, eds.
Modern Clinical Molecular Techniques. New
6. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum
York, US: Springer; 2012: 11-22.
C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial sequen-
cing and analysis of the human genome. Na- 23. Zheng YL, Amin ND, Hu YF, Rudrabhatla
ture 2001; 409: 860-921. P, Shukla V, Kanungo J, et al. A 24-residue
peptide (p5), derived from p35, the Cdk5 neu-
7. Consortium IHGS. Finishing the euchroma-
ronal activator, specifically inhibits Cdk5-p25
tic sequence of the human genome. Nature
hyperactivity and tau hyperphosphorylation.
2004; 431: 931-945.
The Journal of biological chemistry 2010; 285:
8. Chen R, Snyder M. Promise of personalized 34202-34212.
omics to precision medicine. Wiley Interdis-
24. McPherson RA, Pincus MR eds. Henrys
cip Rev Syst Biol Med 2013; 5: 73-82.
clinical diagnosis and management by labo-
9. Guttmacher AE, Collins FS. Genomic medicine- ratory methods (ed 22). Philadelphia, US: El-
-a primer. N Engl J Med 2002; 347: 1512-1520. sevier; 2011.
10. Feero WG, Guttmacher AE, Collins FS. Ge- 25. Valencia A, Coffee B. In Vitro Amplification
nomic medicine--an updated primer. N Engl Methods in Molecular Diagnostics In: Hu P,
J Med 2010; 362: 2001-2011. Hedge MR, Alan P, eds. Modern Clinical Mo-
lecular Techniques. New York, US: Springer;
11. Green ED, Guyer MS. Charting a course for 2012: 49-66.
genomic medicine from base pairs to bedside.
Nature 2011; 470: 204-213. 26. Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonu-
cleic acid polymerase from the extreme ther-
12. Wilkins MH, Stokes AR, Wilson HR. Mole- mophile Thermus aquaticus. J Bacteriol 1976;
cular structure of deoxypentose nucleic acids. 127: 1550-1557.
Nature 1953; 171: 738-740.
27. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ,
13. Watson JD. Molecular Biology of the Gene Higuchi R, Horn GT, et al. Primer-directed
(ed 5ta). USA: Cold Spring Harbor Labora- enzymatic amplification of DNA with a ther-
tory Press; 2003. mostable DNA polymerase. Science 1988;
14. Marx V. Epigenetics: Reading the second ge- 239: 487-491.
nomic code. Nature 2012; 491: 143-147. 28. Weier HU, Gray JW. A programmable sys-
15. Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epi- tem to perform the polymerase chain reac-
genetics in human disease and prospects for tion. DNA 1988; 7: 441-447.
epigenetic therapy. Nature 2004; 429: 457-463. 29. Dieffenbach CW, Lowe TM, Dveksler GS.

General concepts for PCR primer design. PCR 44. Didenko VV. DNA probes using fluorescen-
Methods Appl 1993; 3: S30-37. ce resonance energy transfer (FRET): designs
and applications. Biotechniques 2001; 31:
30. Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. 1106-1116, 1118, 1120-1101.
Product differentiation by analysis of DNA
melting curves during the polymerase chain 45. Mangasser-Stephan K, Tag C, Reiser A,
reaction. Anal Biochem 1997; 245: 154-160. Gressner AM. Rapid genotyping of hemo-
chromatosis gene mutations on the Light-
31. Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Li X, Fan HQ, Cycler with fluorescent hybridization probes.
Cheng ZM, et al. A simple, rapid, high-fide- Clin Chem 1999; 45: 1875-1878.
lity and cost-effective PCR-based two-step
DNA synthesis method for long gene sequen- 46. Balmana J, Diez O, Rubio IT, Cardoso F,
ces. Nucleic Acids Res 2004; 32: e98. Group EGW. BRCA in breast cancer: ESMO
Clinical Practice Guidelines. Ann Oncol 2011;
32. Wang AM, Doyle MV, Mark DF. Quantitation 22 Suppl 6: vi31-34.
of mRNA by the polymerase chain reaction.
Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86: 9717-9721. 47. Spector EB, Grody WW, Matteson CJ, Pa-
lomaki GE, Bellissimo DB, Wolff DJ, et al.
33. Williams PM. The beginnings of real-time Technical standards and guidelines: venous
PCR. Clin Chem 2009; 55: 833-834. thromboembolism (Factor V Leiden and
34. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. prothrombin 20210G >A testing): a disease-
Real time quantitative PCR. Genome Res specific supplement to the standards and
1996; 6: 986-994. guidelines for clinical genetics laboratories.
Genet Med 2005; 7: 444-453.
35. Ginzinger DG. Gene quantification using
real-time quantitative PCR: an emerging te- 48. Smith RA, Cokkinides V, Eyre HJ. Cancer
chnology hits the mainstream. Exp Hematol screening in the United States, 2007: a review
2002; 30: 503-512. of current guidelines, practices, and pros-
pects. CA Cancer J Clin 2007; 57: 90-104.
36. Perez EA, Cortes J, Gonzalez-Angulo AM,
Bartlett JM. HER2 testing: current status and 49. European Association For The Study Of The
future directions. Cancer Treat Rev 2014; 40: L. EASL clinical practice guidelines for HFE
276-284. hemochromatosis. J Hepatol 2010; 53: 3-22.
37. Rodriguez-Gonzalez FG, Mustafa DA, Mos- 50. Bacon BR, Adams PC, Kowdley KV, Powell
tert B, Sieuwerts AM. The challenge of gene LW, Tavill AS, American Association for
expression profiling in heterogeneous clinical the Study of Liver D. Diagnosis and manage-
samples. Methods 2013; 59: 47-58. ment of hemochromatosis: 2011 practice gui-
deline by the American Association for the
38. Mayer G, Muller J, Lunse CE. RNA diagnos- Study of Liver Diseases. Hepatology 2011; 54:
tics: real-time RT-PCR strategies and promi- 328-343.
sing novel target RNAs. Wiley Interdiscip
Rev RNA 2011; 2: 32-41. 51. Maurin M. Real-time PCR as a diagnostic
tool for bacterial diseases. Expert Rev Mol
39. Luu MH, Press RD. BCR-ABL PCR testing in Diagn 2012; 12: 731-754.
chronic myelogenous leukemia: molecular diag-
nosis for targeted cancer therapy and monito- 52. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP,
ring. Expert Rev Mol Diagn 2013; 13: 749-762. Jones MF, Vetter EA, et al. Real-time PCR in
clinical microbiology: applications for routine
40. Ceulemans S, van der Ven K, Del-Favero J. laboratory testing. Clin Microbiol Rev 2006;
Targeted screening and validation of copy 19: 165-256.
number variations. Methods Mol Biol 2012;
838: 311-328. 53. Ayoola A, Barochia A, Belani K, Belani CP.
Primary and acquired resistance to epidermal
41. Van Der Pol B. Cobas(R) 4800: a fully auto- growth factor receptor tyrosine kinase inhibi-
mated system for the detection of Chlamydia tors in non-small cell lung cancer: an update.
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Ex- Cancer Invest 2012; 30: 433-446.
pert Rev Mol Diagn 2013; 13: 131-140.
54. Van Cutsem E, Nordlinger B, Cervantes
42. Sweet KM, Michaelis RC. The Busy A, Group EGW. Advanced colorectal can-
Physicians Guide To Genetics, Genomics cer: ESMO Clinical Practice Guidelines for
and Personalized Medicine. New York, USA: treatment. Ann Oncol 2010; 21 Suppl 5: v93-
Springer; 2011. 97.
43. Hu P, Hedge MR, Alan P eds. Modern Cli-
nical Molecular Techniques. New York, USA:
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Biologa molecular en medicina: nuevas

Article February 2014

John Fredy Castro-lvarez Germn Campuzano-Maya

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Caracterizacin clnica y epidemiolgica de la esclerosis mltiple en el rea metropolitana del Valle

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Biologa molecular en medicina: nuevas

John Fredy Castro-lvarez PhD1, German Campuzano-Maya MD2

Resumen: El avance cientfico y tecnolgico de la biologa molecular en el mundo trajo un nuevo

Conflicto de intereses: los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 11

12 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

El segundo momento en la historia de la biologa molecular se da en el auge de estos

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 13

sistema complejo y dinmico que cambia e induce cambios constantemente al ambiente

ARNm Aminocidos Metabolmica

14 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

ADN ARN Protenas

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 15

16 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

para un adecuado almacenamiento y transmisin de la informacin. 4) La interaccin ADN y protena,

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 17

Replicacin del ADN Cadena nueva

La transcripcin se ha descrito como el paso de la informacin almacenada en las hebras de

18 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 19

Las protenas y la traduccin

20 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

La configuracin tridimensional de la protena y los cambios necesarios para que la protena

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 21

Aislamiento de cidos nucleicos

22 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

mayores concentraciones de ADN, no obstante, el ahorro de tiempo y las condiciones de

Figura 5. Procedimiento para el aislamiento y purificacin de ADN por el mtodo de fenol-cloroformo.

Cuantificacin de cidos nucleicos

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 23

cidos nucleicos (ADN y ARN)

1.0 nucleicos por espectrofotometra.

Almacenamiento y transporte de muestras

degradacin, la contaminacin o contacto Material absorbente

24 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

Amplificacin de cidos nucleicos

Reaccin en cadena de la polimerasa

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 25

Cadena de ADN polimerasa

Figura 9. Componentes necesarios para el desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa. La

Tabla 1. Componentes de una reaccin en cadena La protagonista de la reaccin en cadena

26 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

Diseo de cebadores para la secuencia blanco

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 27

Ciclos de la reaccin en cadena de la polimerasa

Hibridacin Figura 10. Ciclos de la reaccin

28 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 29

Tabla 2. Crecimiento exponencial de ADN en la La reaccin en cadena de la polimerasa

Deteccin de cidos nucleicos

30 Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014.

ADN producto de la reaccin

Figura 11. Electroforesis en gel. A. Representacin esquemtica de la electroforesis en gel y B. Gel

Reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa

Medicina & Laboratorio Volumen 20, Nmeros 1-2, 2014. 31

Tabla 3. Fluoroforos empleados en tcnicas mole- la polimerasa cuantitativa en la prctica

La reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa mide la fluorescencia emitida por los