Borg0040 Ifu 2020-06-29 Ka-Ab Lot 127 - PT
Borg0040 Ifu 2020-06-29 Ka-Ab Lot 127 - PT
English .......................................................................................................................................................................... 2
Deutsch ......................................................................................................................................................................... 7
Français ......................................................................................................................................................................12
Italiano ........................................................................................................................................................................17
Español .......................................................................................................................................................................22
Bibliography / Literatur / Bibliographie / Bibliografia / Bibliografía / Bibliografia .........................................................30
Abbreviations / Abkürzungen / Abréviations / Abbreviazioni / Abreviaciónes / Abreviaturas .....................................30
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles / Legenda / Símbolos / Tabela de símbolos ...............31
Summary of Test Procedure / Kurzanleitung Testdurchführung / Résumé de la procedure de test / Schema della
procedura / Resumen de la técnica / Resumo do Procedimento de Teste ................................................................32
2. INTENDED USE
The Borrelia burgdorferi IgG ELISA is intended for the qualitative determination of IgG class antibodies against Borrelia
burgdorferi in human serum, plasma (citrate, heparin) and CSF (cerebrospinal fluid).
For the determination of intrathecally produced IgG antibodies a separate instruction for use for CSF (BORL0040) can be
obtained at NovaTec.
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4. MATERIALS
4.1. Reagents supplied
Microtiterplate: 12 break-apart 8-well snap-off strips coated with recombinant Borrelia burgdorferi antigens; in
resealable aluminium foil.
IgG Sample Dilution Buffer: 1 bottle containing 100 mL of phosphate buffer (10 mM) for sample dilution; pH 7.2 ± 0.2;
coloured yellow; ready to use; white cap; ≤ 0.0015% (v/v) CMIT/ MIT (3:1).
Stop Solution: 1 bottle containing 15 mL sulphuric acid, 0.2 mol/L; ready to use; red cap.
Washing Buffer (20x conc.): 1 bottle containing 50 mL of a 20-fold concentrated phosphate buffer (0.2 M),
pH 7.2 ± 0.2, for washing the wells; white cap.
Conjugate: 1 bottle containing 20 mL of peroxidase labelled antibody to human IgG in phosphate buffer (10 mM);
coloured blue; ready to use; black cap.
TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 mL 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), < 0.1 %; ready to use;
yellow cap.
Positive Control: 1 vial containing 2 mL control; coloured yellow; ready to use; red cap; ≤ 0.02% (v/v) MIT.
Cut-off Control: 1 vial containing 3 mL control; coloured yellow; ready to use; green cap; ≤ 0.02% (v/v) MIT.
Negative Control: 1 vial containing 2 mL control; coloured yellow; ready to use; blue cap; ≤ 0.0015% (v/v) CMIT/ MIT
(3:1).
For hazard and precautionary statements see 12.1
For potential hazardous substances please check the safety data sheet.
6. REAGENT PREPARATION
It is very important to bring all reagents and samples to room temperature (20…25 °C) and mix them before
starting the test run!
6.1. Microtiterplate
The break-apart snap-off strips are coated with recombinant Borrelia burgdorferi antigens. Immediately after removal of the
strips, the remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at 2...8 °C.
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8. ASSAY PROCEDURE
Please read the instruction for use carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the
instruction for use as described. The following test procedure is only validated for manual procedure. If performing the test on
ELISA automatic systems we recommend increasing the washing steps from three up to five and the volume of Washing Buffer
from 300 µL to 350 µL to avoid washing effects. Pay attention to chapter 12. Prior to commencing the assay, the distribution and
identification plan for all samples and standards/controls (duplicates recommended) should be carefully established on the plate
layout supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder.
Perform all assay steps in the order given and without any delays.
A clean, disposable tip should be used for dispensing each standard/control and sample.
Adjust the incubator to 37 ± 1 °C.
1. Dispense 100 µL standards/controls and diluted samples into their respective wells. Leave well A1 for the Substrate
Blank.
2. Cover wells with the foil supplied in the kit.
3. Incubate for 1 hour ± 5 min at 37 ± 1 °C.
4. When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times
with 300 µL of Washing Buffer. Avoid overflows from the reaction wells. The interval between washing and aspiration
should be > 5 sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue paper prior to the next step!
Note: Washing is important! Insufficient washing results in poor precision and false results.
5. Dispense 100 µL Conjugate into all wells except for the Substrate Blank well A1.
6. Incubate for 30 min at room temperature (20...25 °C). Do not expose to direct sunlight.
7. Repeat step 4.
8. Dispense 100 µL TMB Substrate Solution into all wells.
9. Incubate for exactly 15 min at room temperature (20...25 °C) in the dark. A blue colour occurs due to an enzymatic
reaction.
10. Dispense 100 µL Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate Solution,
thereby a colour change from blue to yellow occurs.
11. Measure the absorbance at 450/620 nm within 30 min after addition of the Stop Solution.
8.1. Measurement
Adjust the ELISA Microtiterplate reader to zero using the Substrate Blank.
If - due to technical reasons - the ELISA Microtiterplate reader cannot be adjusted to zero using the Substrate Blank, subtract its
absorbance value from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results!
Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each standard/control and sample in the
plate layout.
Bichromatic measurement using a reference wavelength of 620 nm is recommended.
Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates.
9. RESULTS
9.1. Run Validation Criteria
In order for an assay run to be considered valid, these Instructions for Use have to be strictly followed and the following criteria
must be met:
Substrate Blank: Absorbance value < 0.100
Negative Control: Absorbance value < 0.200 and < Cut-off
Cut-off Control: Absorbance value 0.150 – 1.300
Positive Control: Absorbance value > Cut-off
If these criteria are not met, the test is not valid and must be repeated.
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9.3. Interpretation of Results
Cut-off 10 NTU -
Antibodies against the pathogen are present.
Positive > 11 NTU
There has been a contact with the antigen (pathogen resp. vaccine).
Antibodies against the pathogen could not be detected clearly.
Equivocal 9 – 11 NTU It is recommended to repeat the test with a fresh sample in 2 to 4 weeks. If the
result is equivocal again the sample is judged as negative.
The sample contains no antibodies against the pathogen.
Negative < 9 NTU
A previous contact with the antigen (pathogen resp. vaccine) is unlikely.
Diagnosis of an infectious disease should not be established on the basis of a single test result. A precise diagnosis should
take into consideration clinical history, symptomatology as well as serological data.
In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value.
10.1. Precision
Intraassay n Mean (E) CV (%)
#1 24 0.517 4.00
#2 24 1.790 4.23
#3 24 2.339 9.04
Interassay n Mean (NTU) CV (%)
#1 12 37.2 4.17
#2 12 45.3 9.28
#3 12 1.9 9.94
10.4. Interferences
Interferences with hemolytic, lipemic or icteric samples are not observed up to a concentration of 10 mg/mL hemoglobin,
5 mg/mL triglycerides and 0.5 mg/mL bilirubin.
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12. PRECAUTIONS AND WARNINGS
The test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed.
The use of the testkits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and
test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not
authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents
for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples.
Only for in-vitro diagnostic use.
All materials of human or animal origin should be regarded and handled as potentially infectious.
All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-HIV antibodies, anti-
HCV antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive.
Do not interchange reagents or Microtiterplates of different production lots.
No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit.
Do not use reagents after expiry date stated on the label.
Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware.
Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination.
Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination.
After first opening and subsequent storage check conjugate and standard/control vials for microbial contamination prior to
further use.
To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense reagents without splashing
accurately into the wells.
The ELISA is only designed for qualified personnel following the standards of good laboratory practice (GLP).
For further internal quality control each laboratory should additionally use known samples.
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DEUTSCH
1. EINLEITUNG
Spirochäten sind spiralig gekrümmte, im Vergleich zu ihrem Durchmesser (0,1-3µm) unproportional lange (bis 250 µm) gram-
negative Bakterien.
Alle pathogenen Spezies gehören zur Familie der Treponemataceae, zu denen folgende Gattungen zählen: Treponema,
Borrelia und Leptospira. Die Treponemen sind schlanke, biegsame Bakterien gewöhnlich in charakteristischer Spiralform.
Borrelien sind zarte (0,2-0,5µm), relativ lange (bis 250 µm) Spirochäten, mit 3-10 ungleichmäßigen Windungen.
Borrelia burgdorferi, der Verursacher der Borreliose-Erkrankung (Lyme-Erkrankung), wird hauptsächlich durch Zecken
übertragen, möglicherweise auch durch andere blutsaugende Insekten. Hauptvektor in Europa ist die Schildzecke Ixodes
ricinus, in den USA Ixodes damini.
Außer B.burgdorferi verursachen auch B. garinii und B. afzelii Lyme-Borreliosen. Die Erkrankung verläuft klassischerweise in
drei Stadien. Sie wurde 1975 in der Kleinstadt Lyme im US-Bundesstaat Connecticut beschrieben. Burgdorfer et al. konnten
1983 den Erreger erstmals isolieren.
Die Lyme-Borreliose ist eine weit verbreitete Krankheit. Eine echte Prophylaxe existiert nicht. Ca. 10-20 % der Zecken in Europa
sind mit Borrelia burgdorferi durchseucht. Die Erkrankungen an Borreliose sind endemisch und treten z.B. in Süddeutschland,
entlang von Flussläufen und im Einzugsgebiet großer Städte gehäuft auf. Den natürlichen Lebensraum stellen vor allem
bewaldete, feucht-warme Regionen Nordamerikas, Europas, Nordafrikas, Australiens und Japans dar.
Saisonale Gipfel akuter Erkrankungen sind die Monate Juni bis September, weitgehend erkrankungsfreie Monate Januar bis
März.
Bevorzugter Personenkreis sind Waldarbeiter, Förster, Jäger und in der Landwirtschaft tätige Personen.
Bedingt durch die Vielzahl möglicher uncharakteristischer Symptome (neurologische, dermatologische, kardiale, rheumatische
Manifestationen möglich) ist die Diagnose der Lyme-Borreliose häufig schwer und erfolgt erst relativ spät.
Nur die frühzeitige Diagnosestellung jedoch ermöglicht eine effiziente Kontrolle der Erkrankung mittels Antibiotika, in der
chronischen Phase sind die Borrelien nahezu unangreifbar.
Spezies Erkrankung Symptome (z.B.) Infektionsweg
Borrelia Lyme- Multisystemerkrankung Übertragung durch
burgdorferi Borreliose Frühmanifestation: Zeckenstich.
Erythema migrans; grippeähnliche Symptome wie Fieber, Europa: Ixodes ricinus
Myalgien und Kopfschmerzen; Karditis; Meningitis USA: Ixodes damini
Spätmanifestationen:
Chronische neurologische, dermatologische und/oder
kardiologische Symptome; Akrodermatitis chronica
atrophicans; Herxheimer Reaktion; Lyme arthritis
Nachweis des Erregers bzw. der Infektion durch:
Mikroskopie
PCR
Serologie: z.B. ELISA
2. VERWENDUNGSZWECK
Der Borrelia burgdorferi IgG ELISA ist für den qualitativen Nachweis spezifischer IgG-Antikörper gegen Borrelia burgdorferi in
humanem Serum, Plasma (Citrat, Heparin) und Liquor bestimmt.
Für die Bestimmung intrathekal produzierter IgG Antikörper kann bei NovaTec eine separate Arbeitsanleitung (BORL0040)
angefordert werden.
3. TESTPRINZIP
Die qualitative immunenzymatische Bestimmung von spezifischen Antikörpern beruht auf der ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay) Technik.
Die Mikrotiterplatten sind mit spezifischen Antigenen beschichtet, an welche die korrespondierenden Antikörper aus der Probe
binden. Ungebundenes Probenmaterial wird durch Waschen entfernt. Anschließend erfolgt die Zugabe eines Meerettich-
Peroxidase (HRP) Konjugates. Dieses Konjugat bindet an die an der Mikrotiterplatte gebundenen spezifischen Antikörper. In
einem zweiten Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt. Die Immunkomplexe, die durch die Bindung des Konjugates
entstanden sind, werden durch die Zugabe von Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung und eine resultierende Blaufärbung
nachgewiesen.
Die Intensität des Reaktionsproduktes ist proportional zur Menge der spezifischen Antikörper in der Probe. Die Reaktion wird
mit Schwefelsäure gestoppt, wodurch ein Farbumschlag von blau nach gelb erfolgt. Die Absorption wird bei 450/620 nm mit
einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen.
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4. MATERIALIEN
4.1. Mitgelieferte Reagenzien
Mikrotiterplatte: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit rekombinanten Borrelia burgdorferi Antigenen; in wieder
verschließbarem Aluminiumbeutel.
IgG-Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche mit 100 mL Phosphatpuffer (10 mM) zur Probenverdünnung; pH 7,2 ± 0,2;
gelb gefärbt; gebrauchsfertig; weiße Verschlusskappe; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/ MIT (3:1).
Stopplösung: 1 Flasche mit 15 mL Schwefelsäure, 0,2 mol/L; gebrauchsfertig; rote Verschlusskappe.
Waschpuffer (20x konz.): 1 Flasche mit 50 mL eines 20-fach konzentrierten Phosphatpuffers (0,2 M), zum Waschen
der Kavitäten; pH 7,2 ± 0,2; weiße Verschlusskappe.
Konjugat: 1 Flasche mit 20 mL Peroxidase-konjugierten Antikörpern gegen humanes IgG in Phosphatpuffer (10 mM);
blau gefärbt; gebrauchsfertig; schwarze Verschlusskappe.
TMB-Substratlösung: 1 Flasche mit 15 mL 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin (TMB), < 0,1 %; gebrauchsfertig; gelbe
Verschlusskappe.
Positivkontrolle: 1 Fläschchen mit 2 mL Kontrolle; gelb gefärbt; rote Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,02% (v/v)
MIT.
Cut-off Kontrolle: 1 Fläschchen mit 3 mL Kontrolle; gelb gefärbt; grüne Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,02%
(v/v) MIT.
Negativkontrolle: 1 Fläschchen mit 2 mL Kontrolle; gelb gefärbt; blaue Verschlusskappe; gebrauchsfertig; ≤ 0,0015%
(v/v) CMIT/ MIT (3:1).
Für Gefahren- und Sicherheitshinweise siehe 12.1.
Für potenzielle Gefahrstoffe überprüfen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt.
6.3. TMB-Substratlösung
Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8 °C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist farblos, kann aber auch leicht
hellblau sein. Sollte die TMB-Substratlösung blau sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden.
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7.1. Probenverdünnung
Proben vor Testbeginn im Verhältnis 1 + 100 mit IgG-Probenverdünnungspuffer verdünnen, z. B. 10 µL Probe und 1 mL IgG-
Probenverdünnungspuffer in die entsprechenden Röhrchen pipettieren, um eine Verdünnung von 1 + 100 zu erhalten; gut
mischen (Vortex).
8. TESTDURCHFÜHRUNG
Arbeitsanleitung vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die
Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert. Beim Arbeiten mit
ELISA Automaten empfehlen wir, um Wascheffekte auszuschließen, die Zahl der Waschschritte von drei auf bis zu fünf und das
Volumen des Waschpuffers von 300 µL auf 350 µL zu erhöhen. Kapitel 12 beachten. Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten
Plattenlayout die Verteilung bzw. Position der Proben und der Standards/Kontrollen (Doppelbestimmung empfohlen) genau
festlegen. Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter einsetzen.
Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen.
Für jeden Pipettierschritt der Standards/Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden.
Den Inkubator auf 37 1 °C einstellen.
1. Je 100 µL Standards/Kontrollen und vorverdünnte Proben in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Vertiefung
A1 ist für den Substratleerwert vorgesehen.
2. Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken.
3. 1 h ± 5 min bei 37 1 °C inkubieren.
4. Am Ende der Inkubationszeit Abdeckfolie entfernen und die Inkubationsflüssigkeit aus den Teststreifen absaugen.
Anschließend dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den Vertiefungen vermeiden.
Das Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte > 5 sec betragen. Nach dem Waschen die Teststreifen auf
Fließpapier ausklopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
Beachte: Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und falschen
Messergebnissen führt!
5. 100 µL Konjugat in alle Vertiefungen, mit Ausnahme der für die Berechnung des Leerwertes A1 vorgesehenen,
pipettieren.
6. 30 min bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen.
7. Waschvorgang gemäß Punkt 4 wiederholen.
8. 100 µL TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren.
9. Genau 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (20...25 °C) inkubieren. Bei enzymatischer Reaktion findet eine
Blaufärbung statt.
10. In alle Vertiefungen 100 µL Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei
Zugabe der TMB-Substratlösung pipettieren, dadurch erfolgt ein Farbwechsel von blau nach gelb.
11. Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stopplösung
messen.
8.1. Messung
Mit Hilfe des Substratleerwertes den Nullabgleich des Mikrotiterplatten-Photometers vornehmen.
Falls diese Eichung aus technischen Gründen nicht möglich ist, muss nach der Messung der Extinktionswert des
Substratleerwertes von allen anderen Extinktionswerten subtrahiert werden, um einwandfreie Ergebnisse zu erzielen!
Extinktion aller Kavitäten bei 450 nm messen und die Messwerte der Standards/Kontrollen und Proben in das Plattenlayout
eintragen.
Eine bichromatische Messung mit der Referenzwellenlänge 620 nm wird empfohlen.
Falls Doppel- oder Mehrfachbestimmungen durchgeführt wurden, den Mittelwert der Extinktionswerte berechnen.
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9.2. Messwertberechnung
Der Cut-off ergibt sich aus dem Mittelwert der gemessenen Extinktionen der Cut-off Kontrolle.
Beispiel: 0,44 OD Cut-off Kontrolle + 0,42 OD Cut-off Kontrolle = 0,86 : 2 = 0,43
Cut-off = 0,43
10. TESTMERKMALE
Die Ergebnisse beziehen sich auf die untersuchten Probenkollektive; es handelt sich nicht um garantierte Spezifikationen.
Für weitere Informationen zu den Testmerkmalen kontaktieren Sie bitte NovaTec Immundiagnostica GmbH.
10.1. Präzision
Intraassay n Mittelwert (E) Vk (%)
#1 24 0,517 4,00
#2 24 1,790 4,23
#3 24 2,339 9,04
Interassay n Mittelwert (NTU) Vk (%)
#1 12 37,2 4,17
#2 12 45,3 9,28
#3 12 1,9 9,94
10.4. Interferenzen
Hämolytische, lipämische und ikterische Proben ergaben bis zu einer Konzentration von 10 mg/mL Hämoglobin, 5 mg/mL
Triglyceride und 0,5 mg/mL Bilirubin keine Interferenzen im vorliegenden ELISA.
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10.5. Kreuzreaktivität
Durch Verwendung rekombinanter Antigene werden Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen folgende Erreger weitestgehend
ausgeschlossen:
- Treponema pallidum
- Leptospirap
- Borrelia recurrentis
Eine Syphilis-Infektion sollte ausgeschlossen werden, da vereinzelt Antikörper gegen p41i auftreten können.
12.2. Entsorgungshinweise
Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen
Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von Sonderabfällen.
13. BESTELLINFORMATIONEN
Produktnummer: BORG0040 Borrelia burgdorferi IgG ELISA (96 Bestimmungen)
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FRANÇAIS
1. INTRODUCTION
Les spirochètes sont des bactéries mobiles avec un filament axial périplasmatique. Toutes les espèces pathogènes
appartiennent à la famille Treponemataceae, qui comprend les trois genres: Treponema, Borrelia et Leptospira. Les
Treponemae sont des cellules extrêmement longues, flexibles et filamenteuses qui sont habituellement maintenues dans une
spirale caractéristique ou en forme de ressort enroulé. Borreliae est la plus grande des Treponemataceae aux spirales très
grossières et ir
régulières. Borrelia burgdorferi, l'agent causal de la maladie de Lyme, est transmise principalement par des tiques, mais
probablement aussi par d'autres insectes suceurs de sang. Les habitats sont les régions boisées, humides et tempérées
d'Amérique du Nord, d'Europe, d'Afrique du Nord, d'Australie et du Japon; Les forestiers, les agriculteurs et toute personne
entrant dans les forêts infestées peuvent être affectées.
Le degré de contamination des tiques s'élève de 3 à 60% selon les différences saisonnières et régionales; Jusqu'à 30% de la
population peut être infectée (environ 1500 cas annuellement aux États-Unis, plusieurs centaines en Europe).
2. INDICATION D’UTILISATION
La trousse Borrelia burgdorferi IgG ELISA est prévue pour la détection qualitative des anticorps IgG anti-Borrelia burgdorferi
dans le sérum humain, plasma (citrate, héparine) et le LCR (liquide céphalo-rachidien).
Pour la détection d'anticorps IgG produits par voie intrathectique, une notice séparée pour l'utilisation de LCR (BORL0040) peut
être obtenue sur demande.
3. PRINCIPE DU TEST
La détermination immunoenzymatique qualitative des anticorps spécifiques est basée sur le la technique ELISA (du anglais,
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Plaques de Microtitrage sont recouvertes d'antigènes spécifiques pour lier les anticorps correspondants de l'échantillon. Après
le lavage des puits pour éliminer l'échantillon détaché, le conjugué peroxydase de raifort (HRP) est ajouté. Ce conjugué se lie
aux anticorps capturés. Dans une deuxième étape de lavage, le conjugué non lié est éliminé. Le complexe immun formé par le
conjugué lié est visualisé par l'addition tétraméthylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu.
L'intensité de ce produit est proportionnelle à la quantité d'anticorps spécifiques dans l'échantillon. L'acide sulfurique est ajouté
pour arrêter la réaction. Cela produit un changement du bleu au jaune. L'absorbance à 450/620 nm est lue en utilisant un
photomètre de Plaques de Microtitrage ELISA.
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4. MATERIEL
4.1. Réactifs fournis
Plaque de Microtitrage: 12 barrettes de 8 puits sécables revêtus d’antigène recombinants de la Borrelia burgdorferi;
en sachets d'aluminium refermables.
Tampon de Dilution d’Échantillon IgG: 1 flacon contenant 100 mL de tampon phosphaté (10 mM) pour la dilution de
l'échantillon; pH 7,2 ± 0,2; prêt à l’emploi; couleur jaune; bouchon blanc; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/ MIT (3:1).
Solution d’Arrêt: 1 flacon contenant 15 mL d'acide sulfurique, 0,2 mol/L; prêt à l’emploi; bouchonrouge.
Tampon de Lavage (concentré x 20): 1 flacon contenant 50 mL d'un tampon phosphaté (0,2 M) concentré 20 fois
(pH 7,2 ± 0,2) pour laver les puits; bouchon blanc.
Conjugué: 1 flacon contenant 20 mL d'anticorps IgG anti-humaines conjuguées à peroxydase du raifort dans le
tampon phosphaté (10 mM); prêt à l’emploi; couleur bleue, bouchon noir.
Solution de Substrat TMB: 1 flacon contenant 15 mL de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB), < 0,1 %; prêt à
l’emploi; bouchon jaune.
Contrôle Positif: 1 flacon contenant 2 mL contrôle; prêt à l’emploi; couleur jaune; bouchon rouge; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
Contrôle Cut-off: 1 flacon contenant 3 mL contrôle; prêt à l’emploi; couleur jaune; bouchon vert; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
Contrôle Négatif: 1 flacon contenant 2 mL contrôle; prêt à l’emploi; couleur jaune; bouchon bleu; ≤ 0,0015% (v/v)
CMIT/ MIT (3:1).
Pour les mentions de danger et les conseils de prudence voir chapitre 12.1
Pour les substances potentiellement dangereuses s'il vous plaît vérifiez la fiche de données de sécurité.
5. STABILITE ET CONSERVATION
Conserver le kit à 2...8 °C. Les réactifs ouverts sont stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette lorsqu'il est
conservé à 2...8 °C.
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7.1. Dilution de l’échantillon
Avant du test, tous les échantillons doivent être dilués 1 + 100 avec Tampon de Dilution d’Échantillon IgG. Diluer 10 µL
d'échantillon avec 1 mL I Tampon de Dilution d’Échantillon IgG dans des tubes pour obtenir une dilution 1 + 100 et mélanger
soigneusement sur un Vortex.
8. PROCEDE DE TEST
Lire attentivement les instructions d’utilisation avant de réaliser le test. La fiabilité des résultats dépend du suivi strict
d'utilisation comme décrit. La technique de test suivante a été validée uniquement pour une procédure manuelle. Si le test doit
être effectué sur un systèmes automatiques pour ELISA, nous conseillons d’augmenter le nombre d’étapes de lavage de trois à
cinq et le volume de la Tampon de Lavage de 300 à 350 µL. Faites attention au chapitre 12. Avant de commencer le test, le
plan de distribution et d'identification de tous les échantillons et les étalons/contrôles (il est recommandé déterminer en double)
doivent être soigneusement établi sur la feuille présentation de la plaque prévue dans le conseil de kit. Sélectionner le nombre
de barrettes ou de puits nécessaires et les placer sur le support.
Réaliser toutes les étapes du test dans l'ordre donné et sans délai.
Un embout de pipette propre et jetable doit être utilisé pour distribuer chaque étalon/contrôle et échantillon.
Régler l'incubateur à 37 ± 1 °C.
1. Pipeter 100 µL de étalons/contrôles et d’échantillons dilués dans leurs puits respectifs. Garder le puits A1 pour le blanc
substrat.
2. Couvrir les puits avec le couvercle, fourni dans le kit.
3. Incuber pendant 1 heure ± 5 minutes à 37 ± 1 °C.
4. A la fin de l'incubation, enlever le couvercle, aspirer le contenu des puits et laver chaque puits trois fois avec 300 µL de
Tampon de Lavage. Éviter les débordements des puits de réaction. L'intervalle entre le cycle de lavage et l'aspiration
doit être > 5 sec. À la fin, enlever soigneusement le liquide restant en tapotant les barrettes sur du papier absorbant
avant la prochaine étape!
Note: L‘étape de lavage est très importante! Un lavage insuffisant peut conduire à une précision faible et de faux
résultats.
5. Pipeter 100 µL du conjugué dans tous les puits sauf le puits Blanc A1.
6. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (20…25°C). N’exposer pas à la lumière directe du soleil.
7. Répéter l'étape numéro 4.
8. Pipeter 100 µL de la Solution de Substrat TMB dans tous les puits.
9. Incuber pendant exactement 15 minutes à température ambiante (20…25°C) dans l'obscurité. Une couleur bleue
se produit en raison d'une réaction enzymatique.
10. Pipeter 100 µL de la Solution d’Arrêt dans tous les puits dans le même ordre et à la même vitesse que pour la Solution
de Substrat TMB, ainsi, il y a un changement du bleu au jaune.
11. Mesurer l'absorbance à 450/620 nm dans les 30 minutes après l'addition de la Solution d’Arrêt.
8.1. Mesure
Réglez le Photomètre de Plaque de Microtitrage ELISA à zéro en utilisant le Blanc substrat.
Si - pour des raisons techniques - le Photomètre de Plaque de Microtitrage ELISA ne peut pas être ajusté à zéro en utilisant le
Blanc substrat, la valeur d’absorbance de cette doit être soustraire la valeur d'absorbance de toutes les autres valeurs
d’absorbance mesurées afin d'obtenir des résultats fiables!
Mesurer l'absorbance de tous les puits à 450 nm et enregistrer les valeurs d'absorbance pour chaque étalon/contrôle et
échantillon dans la présentation de la plaque.
Il est recommandé d'effectuer la mesure dichromatique utilisant 620 nm comme longueur d'onde de référence.
Si doubles déterminations ont été effectuées, calculer les valeurs moyennes d'absorbance.
9. RESULTATS
9.1. Critères de validation
Pour qu'une série d'analyses soit considérée comme valide, ces instructions d'utilisation doivent être strictement suivies, et les
critères suivants doivent être respectés:
Blanc Substrat : Valeur d’absorbance < 0,100
Contrôle Négatif: Valeur d’absorbance < 0,200 et < Cut-off
Contrôle Cut-off: Valeur d’absorbance 0,150 – 1,300
Contrôle Positif : Valeur d'absorbance > contrôle Cut-off
Lorsque ces critères ne sont pas remplis, le test n’est pas valide et doit être recommencé.
14
9.2.1. Résultats en unités [NTU]
Valeur (moyenne) d'absorbance de l’ échantillon x 10 = [unités NovaTec = NTU]
Cut-off
Exemple: 1,591 x 10 = 37 NTU
0, 43
10.1. Précision
Intra-essai n moyenne (E) CV (%)
#1 24 0,517 4,00
#2 24 1,790 4,23
#3 24 2,339 9,04
Inter-essai n moyenne (NTU) CV (%)
#1 12 37,2 4,17
#2 12 45,3 9,28
#3 12 1,9 9,94
10.4. Interférences
Des échantillons hémolytiques ou lipémiques ou ictériques n’ont pas montré d’interférences, avec des concentrations jusqu’à
10 mg/mL de hémoglobine, 5 mg/mL de triglycérides et 0,5 mg/mL de bilirubine.
15
11. LIMITES DE LA TECHNIQUE
Une contamination bactérienne ou des cycles de congélation/décongelation répétés de l`échantillon peuvent affecter les valeurs
d'absorption.
12.1. Note de sécurité pour les réactifs contenant des substances dangereuses
Les réactifs peuvent contenir du CMIT/MIT (3 :1) ou du MIT (voir chapitre 4.1)
Par conséquent, les mentions de danger et les conseils de prudence suivants s’appliquent.
De plus amples informations peuvent être trouvées dans la fiche de données de sécurité.
16
ITALIANO
1. INTRODUZIONE
Le Spirochete appartengono alla famiglia dei Treponomataceae che comprende le specie Treponema, Borrelia e Leptospira.
Hanno una lunghezza di 250µm, sono gram negativi con un diametro di 0,1-3 µm. La Borrelia burgdorferi é l’agente eziologico
del morbo di Lyme. Viene trasmessa soprattutto dalle zecche Ixodes dammini e Ixodes pacificus. Nel 1975 è stata scoperta per
la prima volta a Lyme USA. Burgdorfer et al. hanno isolato per la prima volta il batterio nel 1983. Il morbo di Lyme è una
malattia molto diffusa nel mondo. Non esiste una vera profilassi. Il 10-20 % circa delle zecche europee sono contaminate. I
focolai naturali sono boschi umidi e caldi in Europa, Nord America, Africa, Australia e Giappone. La distribuzione stagionale
della malattia individua un picco costantemente presente in tarda primavera-inizio estate (Giugno-Luglio), mentre i sintomi più
tardivi si concentrano in autunno-inizio inverno. A causa dei sintomi poco specifici la diagnosi è difficile e viene fatta spesso
troppo tardi. La terapia con antibiotici è efficace soltanto dopo una diagnosi precoce, nella fase cronica la cura diventa molto
difficile.
Specie Malattia Sintomi (p.es.) Via di trasmissione
Borrelia Malattia di Lyme Malattia multisistemica Puntura di zecche
burgdorferi (borreliosi) Manifestazioni precoci: eritema migrante; sintomi simil- Europa : Ixodes ricinus
influenzali, come febbre, mialgie e mal di testa; USA: Ixodes dammini
pancardite; meningite
2. USO PREVISTO
Il Borrelia burgdorferi IgG ELISA è un kit per la determinazione qualitativa degli anticorpi specifici della classe IgG per Borrelia
burgdorferi nel siero, plasma (citrato, eparina) umano e LCR (liquido cerebrospinale).
Per la determinazione di anticorpi IgG prodotti per via intratecale, l’istruzione per l'uso de LCR -liquido cerebrospinale-
(BORL0040), possono essere ottenuti presso NovaTec.
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4. MATERIALI
4.1. Reagenti forniti
Piastre di Microtitolazione: 12 strisce divisibili in 8 pozzetti, con adesi antigeni ricombinanti della Borrelia burgdorferi;
dentro una busta d’alluminio richiudibile.
Tampone Diluizione del Campione IgG: 1 flacone contenente 100 mL di tampone fosfato (10 mM) per diluire i
campioni; pH 7,2 ± 0,2; colore giallo; pronto all’uso; tappo bianco; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/ MIT (3:1).
Soluzione Bloccante: 1 flacone contenente 15 mL di acido solforico, 0,2 mol/L, pronto all’uso; tappo rosso.
Tampone di Lavaggio (20x conc.): 1 flacone contenente 50 mL di un tampone fosfato concentrato 20 volte (0,2 M)
per il lavaggio dei pozzetti; pH 7,2 ± 0,2; tappo bianco.
Coniugato: 1 flacone contenente 20 mL di anticorpi IgG anti-umani, coniugati a perossidasi in tampone fosfato
(10 mM); colore azzurro; pronto all’uso; tappo nero.
Soluzione Substrato TMB: 1 flacone contenente 15 mL di 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB), < 0,1 %; pronto
all’uso; tappo giallo.
Controllo Positivo: 1 flacone da 2 mL controllo; colore giallo; tappo rosso; pronto all’uso; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
Controllo Cut-off: 1 flacone da 3 mL controllo; colore giallo; tappo verde; pronto all’uso; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
Controllo Negativo: 1 flacone da 2 mL controllo; colore giallo; tappo blu; pronto all’uso; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/ MIT
(3:1).
Le indicazioni di pericolo e consigli di prudenza vedi capitolo 12.1.
Per le sostanze potenziali pericolose si prega di leggere la scheda di dati di sicurezza.
5. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Conservare il kit a 2...8 °C. I reagenti aperti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta quando sono conservati
a 2...8 °C.
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7.1. Diluizione dei campioni
Prima del test, diluire i campioni 1+100 con Tampone Diluizione del Campione IgG. Per esempio, pipettare nelle provette 10 µL
di campione + 1 mL di Tampone Diluizione del Campione IgG e mescolare bene (Vortex).
8. PROCEDIMENTO
Leggere bene le istruzioni per l’uso prima di iniziare il teste. L’affidabilità dei risultati dipende dalla stretta aderenza le istruzioni
per l’uso di prova come descritto. La seguente procedura è stata validata per l’esecuzione manuale. Per un’esecuzione su
strumentazione automatica si consiglia di incrementare il numero di lavaggi de 3 a 5 volte e il volume della Tampone di
Lavaggio da 300 a 350 µL per evitare effetti di lavaggio. Prestare attenzione al capitolo 12. Stabilire innanzitutto il piano di
distribuzione e identificazione dei campioni e standards/controlli (è raccomandato determinare in duplicato) sullo schema della
piastra fornito con il kit. Inserire i pozzetti necessari nel supporto.
Eseguire il test nell’ordine stabilito dalle istruzioni, senza ritardi.
Sul pipettaggio utilizzare puntali nuovi e puliti per ogni campione e standard/controllo.
Regolare l’incubatore a 37 ± 1 °C.
1. Pipettare 100 µL di standard/controllo e di campione diluito nei relativi pozzetti. Usare il pozzetto A1 per il Bianco-
substrato.
2. Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva, fornita nel kit.
3. Incubare 1 ora ± 5 min a 37 ± 1 °C.
4. Al termine dell’incubazione, togliere la pellicola e aspirare il liquido dai pozzetti. Successivamente lavare i pozzetti tre
volte con 300 µL di Tampone di Lavaggio. Evitare che la soluzione trabocchi dai pozzetti. L’intervallo tra il lavaggio e
l’aspirazione deve essere > 5 sec. Dopo il lavaggio picchiettare delicatamente i pozzetti su una carta assorbente per
togliere completamente il liquido, prima del passo successivo.
Attenzione: Il lavaggio è una fase molto importante. Da lavaggio insufficiente risulta una bassa precisione e
risultati falsi!
5. Pipettare 100 µL di Coniugato in tutti i pozzetti, escludendo quello con il Bianco-substrato (Blank) A1.
6. Incubare per 30 min a temperatura ambiente (20...25 °C). Non esporre a fonti di luce diretta.
7. Ripetere il lavaggio secondo punto 4.
8. Pipettare 100 µL di Soluzione Substrato TMB in tutti i pozzetti.
9. Incubare precisamente per 15 min a temperatura ambiente (20...25 °C) al buio. Un colore blu verifica a causa
della reazione enzimatica.
10. Pipettare 100 µL di Soluzione Bloccante in tutti i pozzetti, nello stesso ordine della Soluzione Substrato TMB, in tal
modo un cambiamento di colore dal blu al giallo si verifica.
11. Misurare l’assorbanza a 450/620 nm entro 30 min dopo l’aggiunta della Soluzione Bloccante.
8.1. Misurazione
Regolare il fotometro per le Piastre di Microtitolazione ELISA a zero usando il substrato-Bianco (Blank).
Se, per motivi tecnici, non è possibile regolare il fotometro per le Piastre di Microtitolazione a zero usando il Bianco-substrato, il
valore de assorbanza de questo deve essere sottratto dai valori dell’assorbanza da tutti i valori delle altre assorbanze per
ottenere risultati affidabili!
Misurare l’assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e inserire tutti i valori misurati nello schema della piastra.
È raccomandato fare le misurazioni delle onde bichrome (due colori). Utilizzando la lunghezza d’onda de 620 nm come misura
di riferimento.
Dove sono state misurate in doppio, calcolare la media delle assorbanze.
9. RISULTATI
9.1. Validazione del test
Affinché un test possa essere considerato valido, le presenti Istruzioni per l'uso devono essere rigorosamente seguite e devono
essere soddisfatti i seguenti criteri:
Substrato Bianco (Blank): Valore di assorbanza < 0,100
Controllo Negativo: Valore di assorbanza < 0,200 e < Cut-off
Controllo Cut-off: Valore di assorbanza 0,150 – 1,300
Controllo Positivo: Valore di assorbanza > Cut-off
Se non sono soddisfatti questi criteri, il test non è valido e deve essere ripetuto.
19
9.2.1. Risultati in unità [NTU]
Assorbanza media del campione x 10 = [unità NovaTec = NTU]
Cut-off
Esempio: 1,591 x 10 = 37 NTU
0,43
La diagnosi di una malattia infettiva non deve essere fatta soltanto sulla risultanza di un unico test.
È importante considerare anche l’anamnesi ed i sintomi del paziente.
I risultati del test da pazienti immunosoppressi e neonati hanno un valore limitato.
10.1. Precisione
Intradosaggio n Media (E) CV (%)
#1 24 0,517 4,00
#2 24 1,790 4,23
#3 24 2,339 9,04
Interdosaggio n Media (NTU) CV (%)
#1 12 37,2 4,17
#2 12 45,3 9,28
#3 12 1,9 9,94
20
11. LIMITAZIONI
Una contaminazione da microorganismi o ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono alterare i valori delle
assorbanze.
12.2. Smaltimento
In genere tutte le sostanze chimiche sono considerati rifiuti pericolosi. Lo smaltimento è regolato da leggi nazionali. Per ulteriori
informazioni contattare l’autorità locale.
21
ESPAÑOL
1. INTRODUCCIÓN
Las espiroquetas son bacterias gramnegativas mobiles de forma espiral que son desproporcionadamente largas (hasta 250µm)
en comparación con su diámetro (0,1-3µm). Todas las especies patógenas pertenecen a la familia de las Treponemataceae
que incluyen tres géneros: Treponema, Borrelia y Leptospira.
Las Treponemas son bacterias delgadas, flexibles, normalmente con una forma espiral caracteristica. Las Borrelias son las mas
largas espiroquetas de las Treponematacae con espirales delicadas y irregulares. Borrelia burgdorferi es el causante de la
enfermedad inflamatoria persistente tardía de Lyme que se reportó por primera vez en 1975 en el pueblo de Old Lyme, en el
estado de Connecticut (Estados Unidos). La enfermedad se transmite sobre todo por la picadura de la garrapata,
possiblemente también por otros insectos sanguijuelos. La propagación es a nivel mundial. Una prevención verdadera no
existe. En Europa aprox. entre el 10 y el 20 % de las garrapatas están infectadas con Borrelia burgdorferi. El espacio vital son
las regiones forrestales, humedas-calientes de norte America, Europa, norte de Africa, Australia y Japon. La población de
mayor riesgo son obreros forestales, cazadores y agricultores.
Es una enfermedad difícil de diagnosticar ya que los síntomas se parecen a los de otras enfermedades. Generalmente aparece
una erupción roja característica en el sitio de la picadura que puede pasar inadvertida. La enfermedad terciaria se desarrolla
meses o años después de la infección inicial. Soló el diagnóstico temprano posibilita un control eficaz de la enfermedad con
anitbioticos debido a que en la phase crónica las borrelias son casi inaccesibles.
Especies Enfermedad Síntomas (p.ej.) Vía de transmisión
Borrelia Enfermedad de Enfermedad multisistémica Picadura de garrapatas
burgdorferi Lyme Manifestaciones tempranas: Eritema migratorio; Europa : Ixodes ricinus
Síntomas similares a la gripe, como fiebre, mialgias USA: Ixodes dammini
y cefaleas; carditis; meningitis
Manifestaciones tardías: Síntomas neurológicos,
dermatológicos y/o cardiológicos crónicos;
Acrodermatitis chronica atrophicans; Reacción de
Herxheimer; Lyme-Artritis
La infección o la presencia de un patógeno puede identificarse mediante:
Microscópia
PCR
Serología: p.ej. ELISA
2. USO PREVISTO
El enzimoinmunoensayo Borrelia burgdorferi IgG ELISA se utiliza para la determinación cualitativa de anticuerpos IgG
específicos contra Borrelia burgdorferi en suero, plasma (citrato, heparina) humano e y LCR (líquido cefalorraquídeo).
Para la determinación de anticuerpes IgG producidos de manera intratecal, una instrucción separada (BORL0040) para el uso
de líquido cefaloraquídeo (LCR) se puede obtener en NovaTec.
22
4. MATERIALES
4.1. Reactivos suministrados
Placa de Microtitulacións: 12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con antígenos recombinante de Borrelia
burgdorferi, en bolsa de aluminio.
Tampón Diluyente para la Muestra IgG: 1 botella de 100 mL de solución de tampón de fosfato (10 mM) para diluir la
muestra; pH 7,2 ± 0,2; color amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/ MIT (3:1).
Solución de Parada: 1 botella de 15 mL de ácido sulfúrico, 0,2 mol/L, listo para ser utilizado; tapa roja.
Tampón de Lavado (20x conc.): 1 botella de 50 mL de una solución de tampón de fosfato 20x concentrado (0,2 M)
para lavar los pocillos; pH 7,2 ± 0,2; tapa blanca.
Conjugado: 1 botella de 20 mL de conjugado de anticuerpos IgG anti-humano con peroxidasa en tampón de fosfato
(10 mM); color azul; tapa negra; listo para ser utilizado.
Solución de Sustrato de TMB: 1 botella de 15 mL 3,3’,5,5’-tetrametilbenzindina (TMB), ˂ 0,1 %; listo para ser
utilizado; tapa amarilla.
Control Positivo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa roja; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
Control Cut-off: 1 botella de 3 mL control; color amarillo; tapa verde; listo para ser utilizado; ≤ 0,02% (v/v) MIT.
Control Negativo: 1 botella de 2 mL control; color amarillo; tapa azul; listo para ser utilizado; ≤ 0,0015% (v/v) CMIT/
MIT (3:1).
Para indicaciones de peligro y consejos de prudencia consulte el cap. 12.1.
Para sustancias potencialmente peligrosas por favor revise la ficha de datos de seguridad.
5. ESTABILIDAD Y ALMACENAJE
Almacene el kit a 2... 8 °C. Los reactivos abiertos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se
almacena a 2... 8 °C.
23
7.1. Dilución de las muestras
Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relación 1 + 100 con el Tampón Diluyente para la Muestra IgG, por
ejemplo 10 µL de la muestra con 1 mL de Tampón Diluyente para la Muestra IgG, mezclar bien con la mezcladora Vortex.
8. PROCEDIMIENTO
Por favor, leer cuidadosamente las instrucciones de uso del ensayo antes de realizarlo. Para el buen funcionamiento de la
técnica es necesario seguir las instrucciones. El siguiente procedimiento es válido solamente para el método manual. Si se
realiza el ensayo en los sistemas automáticos de ELISA es aconsejable elevar el número de lavados de tres hasta cinco veces
y el volumen de Tampón de Lavado de 300 µL a 350 µL para excluir efectos de lavado. Preste atención al capítulo 12. Antes de
comenzar, especificar exactamente la repartición y posición de las muestras y de los estándares/controles (se recomienda
determinar en duplicado) en el esquema de la placa suministrada. Usar la cantidad necesaria de tiras o pocillos e insertarlos en
el soporte.
Realizar el ensayo en el orden indicado y sin retraso.
Para cada paso de pipeteado en los estándares/controles y en las muestras, usar siempre puntas de pipeta de un solo uso.
Graduar la incubadora a 37 1 °C.
1. Pipetear 100 µL de estándares/controles y muestras en los pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el blanco.
2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados.
3. Incubar 1 h ± 5 min a 37 1 °C.
4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la tira y lavarla tres veces con 300 µL del
Tampón de Lavado. Evitar el rebosamiento de los pocillos. El intervalo entre lavado y aspiración debe ser > 5
segundos. Para sacar el líquido restante de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente.
Nota: El lavado es muy importante! Un mal lavado insuficiente provoca una baja precisión y resultados falsamente
elevados!
5. Pipetar 100 µL de conjugado en cada pocillo con excepción del blanco substrato A1.
6. Incubar 30 min a la temperatura ambiente (20…25 °C). Evitar la luz solar directa.
7. Repetir el lavado como en el paso numero 4.
8. Pipetar 100 µL da Solución de Sustrato de TMB en todos los pocillos.
9. Incubar exactamente 15 min en oscuridad a temperatura ambiente (20...25 °C). Un color azul se produce en las
muestras positivas debido a la reacción enzimática.
10. Pipetear en todos los pocillos 100 µL de la Solución de Parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo como
con el Solución de Sustrato de TMB, por lo tanto un cambio de color de azul a amarillo se produce.
11. Medir la extinción con 450/620 nm en un periodo de 30 min después de añadir la Solución de Parada.
8.1. Medición
Ajustar el fotómetro de Placa de Microtitulación ELISA al cero utilizando el Blanco.
Si por razones técnicas el fotómetro de Placa de Microtitulación de ELISA no se puede ajustar a cero utilizando el Blanco, el
valor de la absorbancia de este debe ser sustraído de los demás valores de absorbancia medidos con el fin de obtener
resultados fiables!
Medir la extinción de todos los pocillos con 450 nm y anotar los resultados de los estándares/controles y de las muestras en el
esquema de la placa.
Es aconsejable realizar la medición bicromática a una longitud de onda de referencia de 620 nm.
Si se efectuaron análisis en duplicado o múltiples, hay que calcular el promedio de los valores de extinción de los pocillos
correspondientes.
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9.2.1. Resultados en unidades [NTU]
Promedio valor de la extinción de la muestra x 10 = [NovaTec-unidades = NTU]
Cut-off
Ejemplo: 1,591 x 10 = 37 NTU
0,43
10.1. Precisión
Intra ensayo n Promedio (E) CV (%)
#1 24 0,517 4,00
#2 24 1,790 4,23
#3 24 2,339 9,04
Inter ensayo n Promedio (NTU) CV (%)
#1 12 37,2 4,17
#2 12 45,3 9,28
#3 12 1,9 9,94
10.4. Interferencias
Las muestras lipémicas, ictéricas e hemolíticas no mostraron interferencias con este equipo ELISA hasta una concentración de
5 mg/mL para triglicéridos, de 0,5 mg/mL para bilirrubina y de 10 mg/mL hemoglobina.
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10.5. Reactividad cruzada
Usando antígenos recombinantes una reacción cruzada con anticuerpos contra los siguientes patógenos puede ser excluido la
mejor manera posible:
- Treponema pallidum
- Leptospira
- Borrelia recurrentis
La infección por sífilis debe excluirse, porque podrían aparecer los anticuerpos contra p41i.
12.1. Nota de seguridad para los reactivos que contienen sustancias peligrosas
Los reactivos pueden contener CMIT/MIT (3:1) o MIT (consulte el cap. 4.1)
Por lo tanto, se aplican las indicaciones de peligro y consejos de prudencia.
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29
BIBLIOGRAPHY / LITERATUR / BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAFÍA /
BIBLIOGRAFIA
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30
SYMBOLS KEY / SYMBOLSCHLÜSSEL / EXPLICATION DES SYMBOLES / LEGENDA /
SIMBOLOS / TABELA DE SIMBOLOS
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por /
Fabricado por
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif médical de
IVD diagnostic in vitro / Diagnostico in vitro / Producto para diagnóstico In vitro / Dispositivo
Médico para Diagnóstico In Vitro
LOT Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de lot / Lotto / Número de lote / Número
de lote
Expiration Date / Verfallsdatum / Date de péremption / Scadenza / Fecha de
caducidad / Data de Validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de
Armazenamento
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / Marca CE / Marca CE
31
SUMMARY OF TEST PROCEDURE / KURZANLEITUNG TESTDURCHFÜHRUNG / RÉSUMÉ DE LA
PROCEDURE DE TEST / SCHEMA DELLA PROCEDURA / RESUMEN DE LA TÉCNICA / RESUMO
DO PROCEDIMENTO DE TESTE
Test Preparation
Assay Procedure
32